人工栽培北冬虫夏草子实体对大鼠下丘脑GnRH细胞mRNA表达的调节作用

目的观察人工栽培北冬虫夏草子实体细粉和复合粉对下丘脑促性腺激素释放激素细胞(GnRH细胞)作用的影响。方法用腺嘌呤加入饲料喂饲大鼠,造成大鼠肾阳虚模型,用人工栽培的北冬虫夏草子实体细粉和复合粉进行治疗,通过分子原位杂交的方法显示下丘脑GnRH细胞的mRNA表达以观察北冬虫夏草子实体细粉对其的影响。结果与正常组相比,模型组的Gn-RH细胞杂交信号减弱,阳性细胞数减少,而中药组GnRH杂交信号及阳性细胞数较模型组有提高趋势。结论人工栽培的北冬虫夏草子实体细粉和复合粉可促进大鼠下丘脑GnRH细胞的mRNA表达,增加GnRH分泌,从而调节大鼠的生殖功能。

GnRH免疫活性细胞和神经在大鼠胃肠胰系统分布的初步研究

本研究用免疫金银法。对促性腺激素释放激素(GnRH)免疫活性细胞和神经在大鼠胃肠胰系统的分布,进行了研究。在胃、小肠、大肠和胰腺有GnRH免疫反应阳性的上皮细胞,这些细胞的顶端到达腺腔面或器官腔面,属于开放型的内分泌细胞。在胃和小肠的肌间神经丛、粘膜下神经丛和浆膜下,有GnRH免疫活性神经细胞。在小肠的粘膜下层和固有层,有GnRH免疫活性神经纤维。这些结果提示,GnRH对消化生理可能有重要的意义。

GnRH-A和紫萁抑制大黄鱼性腺早熟的机制

应用脑垂体组织生理学和免疫组织化学方法 ,对GnRH A和紫萁抑制大黄鱼性早熟的作用机制进行了研究。结果表明 ,性早熟大黄鱼脑垂体许多促性腺激素分泌细胞的胞质出现空泡 ,提示性早熟的原因可能是由于GtH细胞提早进入分泌活动所致。长期服用促性腺激素释放激素类似物的养殖大黄鱼 (没有性早熟 ) ,它的脑垂体GtH细胞对GnRH抗独特型抗体发生弱的免疫阳性反应 ,而对照组性早熟鱼仍出现强的反应 ,表明实验组大黄鱼脑垂体GtH细胞对GnRH A的应答能力下降 ,出现脱敏效应 ,这可能与GnRH A抑制大黄鱼性早熟有关。养殖大黄鱼长期服用紫萁 ,它的脑垂体GtH细胞膜上GnRH受体则没有出现脱敏现象 ,提示紫萁抑制大黄鱼性早熟的机制不同于GnRH类似物 。

鸡卵泡细胞GnRH受体定位和定量分析

本实验采用免疫组织化学ＰＡＰ法对体外培养的鸡卵泡细胞进行ＧｎＲＨ受体定位检查，证明了卵泡颗粒细胞（ＧＣ）和膜细胞（ＴＣ）上均存在能与鸡ＧｎＲＨ结合的阳性物质。应用放射配体结合法对ＧＣ和ＴＣ的ＧｎＲＨ受体定量分析，获得如下结果：１２５ⅠＧｎＲＨⅡ与ＧＣ或ＴＣ结合率随未标记配体的增加而减少，表现出专一的竞争抑制结合；ＧＣ的ＧｎＲＨ受体亲和常数ＫＡ＝１１１×１０８Ｍ－１，结合位点为４９ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白；ＴＣ的ＧｎＲＨ受体ＫＡ＝１１３×１０８Ｍ－１，结合位点为５３ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白。鸡的两型ＧｎＲＨ（Ⅰ型和Ⅱ型）与受体竞争结合有较强的交叉结合反应（交叉反应率为８８４％）。ＧｎＲＨ类似物ＬＲＨＡ３与ＧＣ的ＧｎＲＨ受体竞争结合反应率很低，几乎无结合活性。

GnRH在宫颈鳞状细胞癌中的表达及意义

目的:从蛋白质及核酸水平研究GnRH(促性腺激素释放激素)在宫颈鳞状细胞癌中的表达,以探讨其存在的临床意义。方法:采用免疫组化和原位杂交两种实验方法,分别从蛋白质和核酸水平检测45例宫颈鳞状细胞癌及20例慢性宫颈炎中GnRH的表达。结果:在20例慢性宫颈炎宫颈上皮组织中GnRH及GnRH mRNA表达均为阴性,而在45例宫颈鳞状细胞癌组织中,GnRH阳性表达率为80%,GnRH mRNA阳性表达率为64.44%,即无论是在蛋白质水平还是在核酸水平比较两者均显示差异有显著性;定性及定量比较GnRH及GnRH mRNA在不同临床期别的宫颈癌组织中的表达情况,结果为GnRH定性表达率Ⅰ期50%(6/12),Ⅱa期85.7%(18/21),Ⅱb-期100%(12/12);GnRH mRNA定性表达率,Ⅰb期33.3%(4/12),Ⅱa期71.4%(15/21),Ⅱb-期83.3%(10/12);GnRH及GnRH mRNA在定性上表达有显著差别(P<0.05)。结论:宫颈鳞状细胞癌组织存在较高的GnRH,其有可能参与宫颈鳞状细胞癌发生、发展,为进一步研究通过抑制GnRH的产生,减少宫颈癌的发生及治疗宫颈癌提供了一定的理论基础。

雌激素对GT1-7细胞GnRH分泌及相关基因表达的影响

【目的】研究低浓度雌激素对下丘脑GnRH分泌以及ERα、GnRH等6个生殖相关基因表达的影响.【方法】采用体外培养GT1-7细胞,对照组添加溶剂(无水乙醇),试验组添加雌激素(100pmol/L),培养1、3、6、12、18、24、30、36h收集细胞和培养上清液,利用酶联免疫法(ELISA)测定收集上清液中GnRH浓度,并利用相对荧光定量法测定目的基因的表达.【结果】与对照组相比,试验组GnRH分泌呈增加趋势,培养12h左右GnRH分泌达到峰值(P<0.05);ERα、GnRH、Kiss-1、GPR54mRNA相对表达量先增加后降低,4种基因mRNA依次在18h(P<0.01)和24h(P<0.05)、6h(P<0.01)、3h(P<0.01)、6h和12h(P<0.05)表达显著增加.nNOS和c-fos mRNA相对表达量较对照组呈降低趋势,这2种基因mRNA依次在30h和36h(P<0.05)、3h(P<0.01)表达显著降低.【结论】100pmol/L雌激素能够促进GT1-7细胞分泌GnRH,这种作用可能是通过调控ERα、GnRH、Kiss-1、GPR54、nNOS以及c-fos mRNA的表达实现的.

GnRHⅡ对离体培养子宫内膜异位症间质细胞凋亡的影响

目的:研究GnRHⅡ对子宫内膜异位症(内异症)患者离体培养的异位及在位子宫内膜间质细胞凋亡的影响。方法:体外原代培养人内异症异位及在位子宫内膜间质细胞,用不同浓度的GnRHⅡ(0、10-10、10-8、10-6mol/L)干预,采用Hoechst染色和流式细胞术检测离体培养子宫内膜间质细胞的凋亡发生情况。结果:GnRHⅡ可诱导离体培养的在位或异位子宫内膜间质细胞的凋亡,随着浓度增加,差异有统计学意义(P<0.05),呈剂量依赖性;且对异位内膜间质细胞的促凋亡作用明显强于在位者(P<0.05)。结论:外源性GnRHⅡ可明显促进人内异症异位及在位子宫内膜间质细胞的凋亡,为开发内异症促凋亡治疗方面的新药提供了实验依据。

GnRH/M2融合蛋白致敏DC疫苗对黑色素瘤B16F10细胞移植瘤的抑制

目的:制备促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone,GnRH)与M2的融合蛋白(GnRH/M2),研究由该融合蛋白致敏而成的DC疫苗对黑色素瘤B16F10细胞小鼠移植瘤的抑制作用。方法:构建表达载体p ET28a-ans B-CGnRH3-hinge-MVP-M2质粒,该质粒转化的工程菌在乳糖的诱导下,融合蛋白ans B-C-GnRH3-hinge-MVP-M2以包涵体形式表达,经超声破碎、洗涤和乙醇分级沉淀纯化后,通过酸水解将蛋白多肽GnRH3-hinge-MVP-M2释放出来,并通过DEAE-52阴离子交换层析进行分离。将此融合多肽致敏DC获得DC疫苗。构建黑色素瘤B16F10细胞小鼠移植瘤模型,按接种疫苗不同,分为:环磷酰胺组(CTX)、GnRH/M2融合蛋白致敏DC组(GDC)、肿瘤细胞裂解物致敏DC组(BDC)、GnRH/M2融合蛋白致敏DC+环磷酰胺组(GDCTX)、肿瘤细胞裂解物致敏DC+环磷酰胺组(BDCTX)和生理盐水组(NS),观察GnRH/M2疫苗对模型小鼠的移植瘤生长、CTL杀伤能力和T细胞增殖的作用。结果:成功构建p ET28a-ans B-C-GnRH3-hinge-MVP-M2质粒并高效表达融合蛋白。GDC组移植瘤生长明显慢于NS组(P<0.05),且与BDC组相似(P>0.05);GDCTX组抑瘤效果虽进一步提高,但与CTX组相比差异无统计学意义(P>0.05)。各实验组对B16F10细胞的杀伤作用和对T细胞增殖作用均优于阴性对照组(P<0.05或P<0.01),且GDC组与BDC组间差异不显著(P>0.05)。结论:初步证明融合多肽GnRH/M2致敏的DC疫苗能有效抑制黑色素瘤B16F10细胞小鼠移植瘤的生长。

GnRH类似物对培养的大鼠胃平滑肌细胞增殖的影响

目的 观察促性腺激素释放激素 (gonadotropin releasinghormone,GnRH)类似物阿拉瑞林 (alarelin)对培养的大鼠胃平滑肌细胞增殖的影响。 方法 应用离体培养的SD大鼠胃平滑肌细胞 (gastricsmoothmusclecell,GSMC) ,采用四唑盐 (MTT)比色法实验 ,3H 胸腺嘧啶核苷酸 (3H TdR)参入、免疫荧光化学检测增殖细胞核抗原 (pro liferatingcellnuclearantigen ,PCNA)表达的平均荧光值和流式细胞仪技术 ,观察阿拉瑞林对GSMC的增殖、DNA合成和细胞周期的影响。 结果 当加入终浓度为 10 - 9、10 - 7、10 - 5mol L的阿拉瑞林 2 4h后 ,与未用药的对照组相比 ,发现其MTT吸光度 (A值 )逐渐降低 (P <0 0 5 ) ;PCNA表达的平均荧光值逐渐减弱 (P <0 0 5 ) ;GSMC的3H TdR参入量依次减少 (P <0 0 5 ) ,且药物浓度越大 ,此三者下降越明显。在细胞周期中 ,与对照组相比 ,G1 期细胞所占比例明显增加 (P <0 0 5 ) ;S期细胞所占比例明显减少 ,且随药物浓度的增加而逐渐减少 (P <0 0 5 )。 结论 GnRH类似物可明显抑制大鼠GSMC的增殖作用 。

促性腺激素释放激素 GnRH 相关肽存在于培养的大鼠垂体前叶促性腺激素细胞

为了探讨垂体促性腺激素细胞中ＧｎＲＨ相关肽（ＧＡＰ）的来源，本实验选用两种特异性抗ＧＡＰ抗体和抗ＦＳＨ－β抗体，采用免疫细胞化学双重染色技术，研究了ＧＡＰ在培养的大鼠垂体前叶细胞内的分布和定位。结果发现一些培养细胞可表达ＧＡＰ，而且ＧＡＰ免疫反应产物和ＦＳＨ免疫反应产物共存于同一种细胞。这表明ＧＡＰ存在于培养的大鼠垂体前叶促性腺激素细胞内。本文讨论了ＧＡＰ的来源及其可能的生物学作用。

同源GnRH对无血清培养鸡卵泡颗粒细胞孕酮分泌的作用

选用产蛋规律的鸡，在一个产蛋序列中，排卵前１～３ｈ剖腹收集各级卵泡，分离颗粒层建立卵泡颗粒细胞无血清单层贴壁培养模型。在此基础上，用不同剂量鸡促性腺激素释放激素（ＧｎＲＨ－Ⅱ）单独处理或与羊ＬＨ（ｏＬＨ）协同处理，并使用ＧｎＲＨ－Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ（ＧＡ），以观察ＧｎＲＨ－Ⅱ对颗粒细胞孕酮分泌的影响。研究获得了以下结果：（１）ＧｎＲＨ－Ⅱ对鸡不同卵抱（Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５）颗粒细胞孕酮分泌均有促进作用，并呈现剂量－反应关系；（２）ＧｎＲＨ－对ｏＬＨ促鸡卵泡颗粒细胞孕酮的分泌有明显的协同作用；（３）ＧｎＲＨ拮抗物使ＧｎＲＨ－Ⅱ的促卵泡颗粒细胞孕酮分泌作用受到阻断。

体外GnRH-α预处理对子宫内膜异位症黄体中期子宫内膜细胞HOXA10表达的影响

目的探讨促性腺激素释放激素α(GnRH-α)对子宫内膜异位症患者黄体中期子宫内膜细胞HOXA10表达的影响。方法选取2014年1月至2016年1月治疗的因子宫腺肌病或卵巢子宫内膜异位囊肿手术治疗的患者10例(观察组),已正常生育的非子宫内膜异位症、非子宫内膜病变、非恶性肿瘤的手术患者6例(对照组)。收集两组患者黄体中期子宫内膜标本,空白组处理后用GnRH-α进行预处理。比较两组子宫内膜间质细胞存活率和凋亡率;检测两组子宫内膜间质细胞HOXA10表达。结果观察组和对照组在同种处理条件下子宫内膜间质细胞存活率比较差异无统计学意义(P>0.05);GnRH-α对观察组和对照组子宫内膜间质细胞存活率无影响(P>0.05);观察组和对照组在同种处理条件下子宫内膜间质细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05);GnRH-α处理下观察组和对照组子宫内膜间质细胞凋亡率分别为(0.041±0.013)%和(0.045±0.020)%,均明显低于空白对照(P<0.05);同种处理条件下的观察组和对照组子宫内膜间质细胞HOXA10表达△CT值比较差异有统计学意义(P<0.05);GnRH-α处理下观察组和对照组子宫内膜间质细胞HOXA10表达△CT值分别为(7.912±0.017)%和(5.510±0.019)%,均明显高于空白对照(P<0.05);GnRH-α处理下观察组子宫内膜间质细胞HOXA10表达△CT值明显高于对照组(P<0.05)。结论体外GnRH-α处理可以增加子宫内膜间质细胞HOXA10的表达,可能对子宫内膜容受性有一定改善。

人胎小肠GnRH-IR细胞的形态测量分析

目的探索不同胎龄人胎小肠GnRH-IR细胞的变化。方法用免疫组织化学方法对44例第9～38周新鲜人胎小肠GnRH-IR细胞染色定位后,用体视学方法对其进行形态学测量分析。结果①GnRH-IR细胞散在分布于人胎小肠的上皮细胞之间和固有层结缔组织中,形态多样;②上皮GnRH-IR细胞比固有层更规则,同肠段上皮GnRH-IR细胞的形状因子(FF)比固有层小(P<0.05);③上皮GnRH-IR细胞比固有层大,上皮GnRH-IR细胞的平均截面面积(A)和平均周长(B)比固有层大(P<0.05);④GnRH-IR细胞的相对数量在肠段之间有差异,其体密度(Vv)、数密度(Nv)从十二指肠到回肠依次减少(P<0.001)。各肠段GnRH-IR细胞数量随胎龄而变化,且上皮和固有层变化不同,在上皮第21～24周以前Vv、Nv随胎龄增加而增大,其后则随胎龄增加而变小;在固有层Vv、Nv随胎龄增加而增多,且第21～24周以前增长明显,以后增长变缓。结论人胎小肠GnRH-IR细胞广泛存在于人胎小肠粘膜上皮和固有层,形态多样,大小不一。数量从十二指肠到回肠依次减少,且随胎龄增加上皮Gn-RH-IR细胞数量与固有层出现不同的变化。

牛垂体细胞体外培养条件下催乳素分泌的调节—TRH、 GnRH、LH和PRL的影响

利用牛垂体细胞体外无血清培养技术,研究了促甲状腺素释放素(TRH)、促性腺激素释放素(GnRH)、促黄体激素(LH)和催乳素(PRL)对牛垂体细胞PRL分泌的调节。细胞在培养箱内预培养24小时后开始各项处理,以后隔24小时采集培养液一次,并换新的相同处理的培养液。结果表明:GnRH和TRH在第一次处理时均能显著增加PRL的分泌。加入1、10、100ng/ml的GnRH可使PRL分泌量分别增加53％(P<0.05)、111％(P<0.01)和60％(P<0.01),而TRH只有在10、100ng/ml的剂量时明显引起PRL释放增加(P<0.01)。第二次处理时细胞对TRH的反应消失,但对GnRH的反应却发生了逆转,PRL分别降低了70％(P<0.05)、68％(P<0.05)和73％(P<0.05)。表明GnRH和TRH在培养初期具有促进垂体细胞释放PRL的作用。LH(1、10、100ng/ml)对牛垂体细胞PRL的分泌无影响。但LH和TRH合用时,100ng/ml LH可明显地降低由TRH引起的PRL分泌(P<0.05)。PRL本身对牛垂体细胞的分泌有自我调节作用,100、1000ng/ml的PRL处理细胞使其分泌的PRL显著下降,分别降低70％(P<0.05)和100％(P<0.001)。此外1000ng/ml的PRL可显著地抑制由GnRH在第一次处理时引起的PRL释放。本实验在垂体细胞水平说明多种激素对PRL的分泌调节具有调控作用。

同源GnRH对鸡卵泡颗粒细胞增殖的影响

在建立鸡卵泡颗粒细胞无血清单层贴壁培养模型的基础上,用鸡促性腺激素释放激素(GnRH-Ⅱ)单独处理,或同时加入 GnRH 拮抗物(GA)或与羊 LH(oLH)协同处理,继续培养48 h 之后,用胰蛋白酶分别消化成单个细胞然后计数。获得结果是:GnRH-Ⅱ能刺激颗粒细胞增殖,同时加入 GA 能阻断 GnRH-Ⅱ的效果;单独加入 oLH 处理能刺激细胞增殖,在加入GnRH-Ⅱ,同时再加入 oLH 处理,其细胞增殖数明显低于单独用 oLH 处理的细胞增殖数目。

新生大鼠下丘脑GnRH免疫反应性神经元的体外发育

应用神经细胞培养、免疫细胞化学、图像分析等技术，研究了新生大鼠下丘脑促性腺激素释放激素（ＧｎＲＨ）神经元的体外发育规律。培养１ｄ即可见ＧｎＲＨ－ＩＲ神经元；１～３ｄ，ＧｎＲＨ－ＩＲ神经元生长最快，胞体和突起的平均生长速度分别为４５．５９μｍ２／ｄ和１９．３９μｍ／ｄ，染色加深；培养７ｄ，ＧｎＲＨ－ＩＲ神经元的胞体截面积、胞体染色强度和突起长度均达最高峰，分别为１７１．２１±４３．１７μｍ２，０．２８９±０．０３４，８７．０１±２２．３３μｍ；培养１４ｄ，ＧｎＲＨ－ＩＲ神经元的胞体大小和突起长度维持在７ｄ时的水平，但染色减弱。结果提示，培养第１周是ＧｎＲＨ神经元体外发育成熟的关键时期。

瘦素对GT1-7细胞GnRH释放的影响

目的 :GT1- 7细胞是替代研究GnRH神经元的理想细胞模型 ,本文观察瘦素 (Leptin)对GT1- 7细胞GnRH释放的影响。方法 :采用氯胺T法放射性核素标记物12 5I标记GnRH ,建立了稳定灵敏的GnRH放射免疫分析方法。将不同浓度的瘦素 ,以不同的时间与GT1- 7细胞孵育 ,用RIA法测定GT1- 7细胞上清液中GnRH含量。结果 :结果表明瘦素能直接作用于GT1- 7细胞株 ,促进GnRH释放 ,以浓度为 2 0ng/ml,孵育 15分钟作用最明显。结论 :瘦素可能通过直接作用于下丘脑GnRH神经元 ,而对生殖功能起调节作用。

大鼠胃壁细胞GnRH受体的定位及GnRH类似物对壁细胞内钙的影响

目的 观察促性腺激素释放激素 (gonadotropin releasinghormone,GnRH)受体在培养的大鼠胃粘膜壁细胞中的定位 ,并探讨GnRH类似物阿拉瑞林 (alarelin)对壁细胞内游离钙动员的机制。 方法 采用免疫组织化学和原位杂交技术 ;应用Ca2 + 指示剂Fluo 3 AM作为细胞内钙离子的荧光探针 ,对负载培养的胃壁细胞 ,应用激光共聚焦显微镜技术检测单个细胞内钙荧光强度的变化。 结果 大鼠胃壁细胞呈GnRH受体免疫反应阳性 ,阳性物质位于细胞质 ,细胞核为阴性 ;同样壁细胞内可检测到GnRH受体mRNA杂交信号 ,阳性物质位于细胞质 ,细胞核为阴性 ;胞内Ca2 + 浓度变化为 :1 在Hank液中 ,GnRH类似物浓度为 10 - 8、10 - 7、10 - 6 mol L时 ,胃壁细胞内Ca2 + 浓度逐渐升高 ,其峰高 (峰值减去静息值 )分别为 7 1± 1 4、12 1± 1 7、16 8± 2 2。其达峰时间也逐渐增快 ,分别为 34 2± 6 4s、18 9± 1 2s、10 4± 2 3s。相邻两组间其峰高及达峰时间均存在显著性差异 (P <0 0 5 ) ,且呈明显剂量依赖性。 2 在D Hank液 (去除外钙 )中 ,阿拉瑞林可轻度短暂升高胞内Ca2 + ;用内罗啶孵育后再加入阿拉瑞林也可轻度短暂升高胞内Ca2 + ,二者无显著性差异。 3 当用拉西地平孵育后再加入阿拉瑞林 ,可明显抑制胞内Ca2 + 的增加?

体外无血清培养的鸡卵泡细胞GnRH样肽分泌的研究

本实验通过12 5Ⅰ标记的鸡GnRH与同源血清 (抗体 )反应 ,建立了鸡GnRH放射免疫分析法 (RIA) ,并用以检测体外无血清培养的鸡卵泡细胞 ,证明卵泡膜细胞 (TC)和颗粒细胞 (GC)培养液中均存在GnRH Ⅱ样肽物质。并发现TC细胞培养液中的GnRH Ⅱ样肽含量在 72h内随培养时间加长而增多 ,而GC细胞培养液中GnRH样肽含量变化不明显。实验结果表明鸡卵泡细胞能产生GnRH