热休克蛋白gp96在恶性肿瘤中的研究进展

热休克蛋白90B1又称为糖蛋白96(gp96).gp96属于热休克蛋白90家族,是一种高度保守且普遍存在的糖蛋白.作为一种内质网蛋白,gp96在维持内质网稳态、内质网应激、钙稳态等方面起着重要的调控作用,这些调控网络在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用.gp96作为分子伴侣在稳定和激活客户蛋白等方面有众多报道,其中包括HER2、整合素和Toll样受体等多个客户蛋白.大量研究表明,gp96在肝癌、乳腺癌、胃癌等不同类型的肿瘤中高表达,并在肿瘤的生长、侵袭和转移等方面起着重要的作用.本文从gp96的基本结构和功能及其在肿瘤发生发展中的作用等方面进行综述,并着重阐述细胞膜gp96相关的研究进展.最后,重点介绍基于胞膜gp96结构所设计的选择性小分子抑制剂、抗体和多肽等药物在肿瘤靶向治疗中的潜在应用.

gp96与免疫相关基因CTLA-4、CD8在肺癌组织芯片中的表达及意义

背景与目的近年来研究显示gp96在机体发挥抗肿瘤的特异性细胞毒免疫应答中发挥重要作用。本研究旨在探讨热休克蛋白gp96与免疫相关基因CTLA-4、CD8在不同进展阶段肺癌中的表达及生物学意义。方法应用免疫组化Envision法及组织芯片技术检测89例原发肺癌、12例癌前病变、10例正常肺组织及12例淋巴结转移性肺癌中gp96、CTLA-4、CD8的表达,并分析其与肺癌临床病理指标的关系。结果①原发性肺癌组gp96的阳性率高于正常组与癌前病变组(P<0.05)。原发性肺癌组和癌前病变组CTLA-4的阳性率均高于正常组(P<0.05)。CD8在原发性肺癌组的阳性率高于正常组(P<0.05)。CD8阳性淋巴细胞高表达组gp96阳性率低于低表达组(P<0.05)。②gp96表达与患者的性别、分化程度和临床分期有关(P<0.05),而与年龄、肉眼类型、组织学分型和有无淋巴结转移无关(P>0.05)。CTLA-4表达与年龄、分化程度有关(P<0.05),而与性别、肉眼类型、组织学分型、临床分期和有无淋巴结转移无关(P>0.05)。CD8表达与临床分期有关(P<0.05),而与性别、年龄、肉眼类型、组织学分型、分化程度和有无淋巴结转移无关(P>0.05)。在鳞癌和小细胞癌中,gp96、CTLA-4的表达阳性率均高于CD8的表达(P<0.05)。③Gp96与CTLA-4表达呈正相关(P<0.05),与CD8表达呈负相关(P<0.05),CD8与CTLA-4表达呈负相关(P<0.05)。结论在肺癌中gp96的表达与CTLA-4、CD8密切相关,提示三者在肺癌的发生发展中起重要作用,可作为评估患者病情和估计预后的参考指标。

热休克蛋白gp96肽复合物诱导的抗肿瘤免疫

目的: 用不同种类肿瘤提取的热休克蛋白 (HSP)gp96 肽复合物纯化后免疫动物,观察其诱导抗肿瘤免疫的效应,并初步探讨其机制。方法: 从肿瘤细胞中制备HSPgp96 肽复合物, 观察其免疫诱导作用。用不同剂量及不同来源的gp96 肽复合物免疫 6组小鼠后, 用H22癌细胞攻击, 观察各组小鼠的肿瘤发生率、瘤重及瘤组织的形态学变化并与对照组相比较。观察gp96 肽复合物对小鼠腹腔巨噬细胞分泌一氧化氮 (NO)和杀瘤活性的影响。结果: 获得的纯化HSPgp96 肽复合物的Mr为 96 000。gp96 肽复合物的免疫效果与其剂量有关, 以 18μg/只的效果最明显。交叉免疫实验证明, 免疫小鼠能抵抗同种肿瘤细胞的攻击, 而对异种肿瘤细胞的则无免疫保护作用。gp96 肽复合物可刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO同时杀瘤活性增高。结论: 从肿瘤细胞中分离纯化的HSPgp96 肽复合物免疫小鼠后, 可获得特异性的抗肿瘤作用; 其对肿瘤细胞的杀伤作用与gp96 肽复合物能增强小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO增多有关。

热休克蛋白gp96-肽复合物的提取及纯化

目的:建立从H22肝癌细胞中提取、纯化热休克蛋白gp96肽复合物的方法。方法:①制备H22肝癌细胞蛋白:将H22肝癌细胞裂解、离心、过滤及透析后获得。②gp96肽复合物的纯化:上述可溶性H22肝癌细胞蛋白经分级硫酸铵盐析后,依次用ConASepharose亲和层析、SephadexG25更换缓冲液及DEAESephacel离子交换层析分离纯化。③gp96肽复合物的鉴定和浓度测定:所得蛋白经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westernblot进行蛋白分子量及性质鉴定,Lowry法测定蛋白浓度。结果:分离、纯化得到的蛋白经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染鉴定为单一带,分子量为96kD;Westernblot结果证实为HSPgp96。每20ml压积H22细胞最终获得1mg的HSPgp96。结论:使用本分离纯化方法可获得高纯度HSPgp96肽复合物。

肝癌基因谱动态表达及HSPgp96异常的临床价值

目的:探讨肝细胞癌变过程中基因表达谱的动态变化,观察热休克蛋白(HSP)gp96表达及其在肝癌早期诊断及判断预后方面的临床价值.方法:以2-乙酰氨基芴(2-FAA,0.05%)喂饲SD大鼠诱发肝癌发生,观察肝病理组织学(HE染色)改变,用全基因组芯片分析肝基因表达谱的动态变化,以巢式逆转录酶链反应扩增gp96基因片段.结果:SD大鼠在喂饲2-FAA后,肝细胞在诱癌早期发生颗粒样变性,中期出现不典型增生,后期见大量癌巢结节.肝癌发生过程中大鼠肝基因表达谱明显改变,与对照大鼠比较,癌变大鼠gp96上调3倍;诱癌变过程中,肝组织gp96 mRNA表达明显增加,变性组,癌前组和癌变组的肝组织中gp96基因表达均明显高于正常对照组(90.9%,100%,100%vs 16.67%,P<0.05).结论:肝细胞癌变过程中基因表达谱明显改变,其中gp96 mRNA呈过度表达,其分析有利于肝癌的诊断和预后判断.

gp96多肽复合物介导的细胞毒性T淋巴细胞对食管腺癌细胞的免疫杀伤作用

目的 :研究肿瘤细胞来源的gp96多肽复合物介导的对同一类型肿瘤的免疫治疗作用。方法 :提取纯化食管腺癌细胞系SEG 1裸鼠成瘤组织的gp96蛋白多肽复合物 ,与外周血单个核细胞 (PBMNC)诱导培养的树突状细胞(DC)结合 ,制备gp96 DC疫苗 ;台盼蓝拒染法测定淋巴细胞增殖率 ;ELISA方法检测细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)培养上清液的γ干扰素 (IFN γ)含量 ,MTT法检测CTL对靶细胞SEG 1的杀伤率。结果 :5 5g瘤组织提取纯化gp96蛋白12 0 μg ;单独DC、单独gp96及gp96 DC均能刺激淋巴细胞增殖 ,产生CTL ,释放IFN γ ,对靶细胞SEG 1均显示一定的杀伤作用 ,以gp96 DC的作用最明显 ,在效靶比 4 0∶1时 ,杀伤率为 6 8%。单独DC诱导的CTL对SEG 1、K5 6 2的杀伤作用与非抗原刺激的淋巴细胞比较 ,统计学差异无显著性。结论 :肿瘤来源的热休克蛋白gp96可使DC具有更强的刺激T淋巴细胞增殖的能力 ,所产生的CTL对靶肿瘤细胞有明显的特异杀伤作用。

热休克蛋白gp96对巨噬细胞功能的影响

背景与目的:热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)gp96在抗原递呈和肿瘤特异性免疫治疗中具有重要作用,但其对巨噬细胞的作用机制尚待深入研究。本研究旨在探讨HSPgp96对小鼠腹腔巨噬细胞(peritonealelicitedmacrophages,PEMφ)功能的影响。方法:应用激光扫描共聚焦显微术,结合特异性荧光探针Fluo3-AM、DAF-FM-DA和H2DCF-DA,检测在HSPgp96作用下,腹腔巨噬细胞内钙离子(Ca2+)、一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)的动态变化,并用荧光标记技术检测小鼠腹腔巨噬细胞MHCⅡ及CD86的表达强度和分布的变化。结果:小鼠腹腔巨噬细胞受HSPgp96刺激后,细胞内Ca2+、NO和ROS的生成量都快速升高,分别在刺激后30s、80s和580s时达峰值,增幅分别为(161.06±70.99)%、(77.58±31.17)%和(647.28±185.70)%。小鼠腹腔巨噬细胞受HSPgp96刺激后MHCⅡ阳性表达率:对照组为(40.9±3.5)%,HSPgp96(60mg/L)组为(61.8±5.1)%;CD86阳性表达率:对照组为(23.1±3.1)%,HSPgp96(60mg/L)组为(54.9±2.0)%。结论:HSPgp96在体外可使小鼠腹腔巨噬细胞内Ca2+、NO及ROS生成量明显增加;使抗原递呈分子MHCⅡ、CD86的表达明显上调。

肿瘤源性热休克蛋白gp96诱导淋巴细胞反应及其抗肿瘤效应

目的研究肿瘤细胞来源的热休克蛋白gp96-多肽复合物在体外诱导脾淋巴细胞的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。方法利用蛋白纯化技术、SDS-PAGE凝胶电泳及Western blot法分离纯化、鉴定gp96-多肽;通过流式细胞术、免疫荧光技术、CCK-8法等检测经gp96多肽诱导的CD8+T细胞及其抗肿瘤效应。结果经鉴定获得纯化的热休克蛋白;流式细胞仪检测表明,经gp96-肽复合物诱导后的CD8+T细胞比例达到近70%,远远高于对照组的35%、26%;该活化的CTL细胞在效靶比为50∶1时的肿瘤杀伤率达72%,与对照组相比具有统计学意义;激光共聚焦显微镜观察证实实验诱导组的培养上清能诱导H22肿瘤细胞凋亡的形态学改变。结论肿瘤来源的热休克蛋白gp96-肽复合物能诱导小鼠脾淋巴细胞的CTL反应,该活化的CTL具有特异性抗H22肿瘤细胞的免疫作用,并能分泌免疫活性物质诱导H22肿瘤细胞凋亡。

gp96、Mcl-1在肝硬化和肝癌组织中表达及意义

目的通过研究gp96、髓样细胞白血病-1(Mcl-1)蛋白在肝硬化和肝癌组织中的表达及临床病理学意义,初步探讨其与肝硬化和肝癌发生、发展的关系。方法采用免疫组织化学ENVISION法分别检测19例肝硬化组织(癌旁肝硬化组织)、32例肝癌组织和21例对照肝组织(癌旁非硬化肝组织)中gp96、Mcl-1的表达,并分析其各自表达与肝癌临床病理学特征的关系。取来源于同一患者的肝癌组织、癌旁肝硬化组织或癌旁非肝硬化组织,分别配对检测gp96、Mcl-1,比较两者的阳性表达率。结果对照组、肝硬化组和肝癌组gp96阳性表达率逐渐递增,差异有统计学意义(P<0.05);gp96的阳性表达与肿瘤有无包膜、TNM分期有关(P<0.05),与患者的性别、年龄、肿瘤大小、血清甲胎蛋白(AFP)值、组织学分级及临床分期无关(P>0.05)。肝癌组和肝硬化组Mcl-1阳性表达率明显高于对照组(P<0.05),但肝癌组和肝硬化组之间差异无统计学意义(P>0.05);Mcl-1阳性表达与肿瘤有无坏死和TNM分期有关(P<0.05)。肝癌组gp96阳性表达率明显高于配对癌旁肝硬化组及配对癌旁非肝硬化组(P均<0.05);而肝癌组Mcl-1阳性表达率明显高于配对癌旁非肝硬化组,与配对癌旁肝硬化组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 gp96、Mcl-1过表达可能与肝癌的发生、发展有关。gp96可能参与了肝硬化的发生、发展及向肝癌的恶性转化,有助于判断肝癌患者的预后。

热休克蛋白HSP70和gp96在抗病毒感染中的作用

热休克蛋白(HSP)是一组在进化上高度保守、具有重要生理功能的蛋白质家族,是生物在应激条件下产生的一种非特异性防御产物,在调节免疫应答和抗病毒反应中起重要作用。现简要介绍HSP70、gp96(HSP96,GRP94)这两种HSP与病毒感染的关系及在抗病毒感染中的作用。

热应激对慢性粒细胞白血病细胞系K562中热休克蛋白gp96表达的影响及其意义

本研究查明不同热应激条件对慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞中热休克蛋白gp96表达量的影响,为寻找增加K562细胞中gp96的提取量的最佳热应激条件提供实验依据。用免疫组织化学方法检测经38、40、42、44、46及48℃水浴热休克处理30分钟后的K562细胞中gp96表达量的变化;以平均阳性细胞百分率和平均荧光强度为指标,用流式细胞术研究40、44、48及52℃各水浴热休克处理30分钟对K562细胞中gp96表达量的影响;利用免疫印记原理,用Westernblot技术研究K562细胞经40、44、48与52℃水浴各休克处理30分钟后gp96表达量的变化。结果表明免疫组织化学方法显示gp96主要在胞浆内表达,在48℃水浴热休克处理30分钟时,强阳性的细胞数最多,积分也最高;流式细胞术显示平均阳性细胞百分率和平均荧光强度均在48℃水浴热休克处理30分钟组达高峰,各温度间gp96表达量的差异有统计学意义;Westernblot显示48℃水浴热休克处理30分钟时gp96的表达量达到高峰,各温度间gp96表达量的差异有统计学意义。结论48℃水浴热休克处理30分钟,gp96在K562细胞中的表达量达到高峰,该条件可作为提取K562细胞gp96的一个有效预处理条件。

热休克蛋白gp96抗肿瘤免疫的研究进展

热休克蛋白 (HSP) gp96是一种高度保守和呈单态性的蛋白质。它具有分子伴侣功能 ,能与细胞内大量多肽非共价结合而不受细胞单倍型和MHC分子的影响。gp96 肽复合物也可在体外形成 ,并具有与体内相似的免疫活性。gp96参与MHCⅠ类抗原的提呈。用肿瘤源gp96 肽复合物免疫小鼠可诱发抗相应肿瘤细胞的MHCⅠ类限制性CD8+ 细胞毒性T细胞免疫应答 ,并能产生记忆性T细胞应答 ,具备了作为疫苗的一个关键要素 ,为肿瘤免疫治疗开辟了一个新的途径。

从K562细胞中提取热休克蛋白GP96及其对人树突状细胞分化和功能的影响

本研究旨在建立从K5 6 2细胞系中提取热休克蛋白GP96的方法 ,进而研究GP96对人树突状细胞分化和功能的影响。采用蛋白分离提纯技术 ,将K5 6 2细胞裂解 ,经饱和硫酸铵沉淀、亲和层析、离子交换层析后提纯出热休克蛋白GP96 ,用SDS PAGE凝胶电泳和Westernblot方法对其进行鉴定。将提纯的GP96加入从正常人外周血单个核细胞诱导培养的树突状细胞 (dendriticcell,DC)中 ,通过流式细胞术检测DC细胞表型变化 ,用MTT法测定混合淋巴细胞反应 (mixedlymphocytereaction ,MLR)。结果表明 :从 1× 10 1 0 K5 6 2细胞中能提纯出热休克蛋白GP96 6 0 - 80 μg ;加入GP96制备的HSP DC ,其细胞表面标志CD83、CD86和HLA DR的表达率比常规培养DC明显升高 ,CD1a表达率降低 (P <0 .0 5 ) ;HSP DC比常规培养DC具有更强的刺激混合淋巴细胞反应的能力 (P <0 .0 5 )。结论 :从K5 6 2细胞中可以提取出热休克蛋白GP96 ;热休克蛋白GP96可以促进树突状细胞分化成熟 。

人乳腺癌中葡萄糖调节蛋白94(Grp94/Gp96)的表达及意义

目的 探讨人乳腺浸润性导管癌中葡萄糖调节蛋白 94 (glucose -regulatedprotein ,GRP94 )的表达与乳腺癌生长、浸润及转移的关系。方法 采用DakoEnvision免疫组织化学染色法对 30例乳腺癌中的GRP94进行免疫组化染色。结果 乳腺浸润性导管癌 30例 ,其中有淋巴结癌转移的 15例 ,GRP94阳性 1例 ,弱阳性 5例 ,阴性 9例 ;无淋巴结癌转移的 15例 ,GRP94阳性 10例 ,弱阳性 2例 ,阴性 3例 ;有淋巴结癌转移组GRP94表达低 ,无淋巴结癌转移组GRP94表达高 ;(P <0 0 5 ) ,两组之间存在显著差异。结论 在乳腺浸润性导管癌中GPR94的表达与转移有关 ,低表达者往往有转移。

肝癌组织热休克蛋白gp96异常表达及其临床病理学特征

目的分析热休克蛋白(HSP)gp96在人肝细胞性肝癌(HCC)及非癌组织中的表达,并探讨其与肿瘤发生、发展及预后的关系。方法采用免疫组织化学方法分别检测30例HCC癌灶组织及其自身对照的非癌组织HSPgp96的表达,并以生物素标记的HBVDNA探针检测肝癌组织中HBVDNA,分析HSPgp96表达与HBV复制及其临床病理学特征的关系。结果无论是原发性肝癌还是转移性肝癌,HSPgp96均呈较高表达;HSPgp96在肝癌灶及非癌组织表达阳性率分别为73.3%和46.7%(P<0.05)。HCC的癌灶组织中HSPgp96阳性表达与肿瘤分化程度及肿瘤大小显著相关(P<0.05),而与肿瘤数目无关(P>0.05)。HBVDNA阳性肝癌组织中HSPgp96表达显著高于HBVDNA阴性组。结论HSPgp96在HCC中过度表达,且与HCC的分化程度和大小有关,可作为肝癌早期诊断及预后判断的标志。

热休克蛋白gp96、髓样细胞白血病-1和阻抑蛋白在肝硬化和肝癌组织中的表达

目的:分析热休克蛋白gp96、髓样细胞白血病-1(MCL-1)和阻抑蛋白(PHB)在LC和HCC组织中的表达及其临床意义.方法:免疫组化二步法分别检测19例LC,32例HCC和21例对照组肝组织中gp96,MCL-1和PHB的表达,并分析其与肝癌临床病理学特征的关系.结果:gp96在对照组、LC组和HCC组的表达逐渐增强(P<0.05);HCC无包膜、有坏死和门静脉有癌栓者gp96表达较高;gp96表达与HCC分化程度呈负相关(r=-0.4655,P=0.0073),与TNM分期呈正相关(r=0.5157,P=0.0025).MCL-1和PHB在HCC组织中过表达,HCC有坏死者MCL-1表达高于无坏死者,HCC无包膜者PHB表达高于有包膜者(P<0.05).结论:gp96,MCL-1和PHB的过表达可能与HCC的发生、发展有关.gp96可能参与LC的发生、发展及向HCC的恶性转化,有助于判断HCC患者的预后.

肺癌gp96-多肽复合物/DC疫苗体外诱导CTL反应的实验研究

目的 研究热休克蛋白gp96 多肽复合物负载树突状细胞 (dendriticcell,DC)后 ,能否诱导出gp96 多肽复合物特异性的细胞毒性T细胞 (cytotoxicTlymphocyte ,CTL)反应。方法 从一例肺癌患者肿瘤组织中提取gp96 多肽复合物和自体肿瘤细胞溶解物 ,分别负载从该患者骨髓血中培养的DC。以不同形式的抗原 /DC疫苗分别刺激由患者外周血中分离的淋巴细胞。采用ELISA法检测淋巴细胞所释放的IFN γ量作为CTL反应的指标 ;以Cr51 释放实验分析致敏后的淋巴细胞对不同靶细胞的裂解和杀伤作用。结果 所有肿瘤抗原致敏淋巴细胞后均可以诱导产生CTL反应 ,其中以gp96 多肽复合物 /DC疫苗诱导释放的IFN γ量最高。肿瘤抗原致敏淋巴细胞后对原代培养的肿瘤细胞的杀伤作用高于PG细胞和K5 62细胞。结论 自体肿瘤组织中提取的gp96 多肽复合物能诱导出肿瘤特异性CTL反应 ,而负载DC后能激发起更强的CTL。

胃癌gp96多肽复合物树突状细胞疫苗对Th1/Th2平衡的影响

目的探讨gp96多肽复合物树突状细胞(dendriticcells,DCs)疫苗对Th1/Th2平衡的影响。方法从胃癌组织中提取gp96多肽复合物负载从外周血单个核细胞诱导培养的DCs,用gp96多肽复合物DC疫苗诱导同一患者Th0淋巴细胞,ELISA检测培养上清中IFNγ和IL10的水平;以胃癌细胞裂解物负载的DC疫苗作对照。结果gp96多肽复合物DC疫苗诱导的T细胞分泌IFNγ的量为(2875±177.66)pg/ml,显著高于对照组(1765±289.07)pg/ml(P<0.01);分泌IL10的量为(36±6.72)pg/ml,显著低于对照组(90±11.26)pg/ml(P<0.05),二者之间存在显著的负相关(r=-0.915,P<0.01)。结论gp96多肽复合物DC疫苗可诱导Th1/Th2平衡向Th1漂移,显示了gp96多肽复合物DC疫苗可显著提高机体的免疫能力,为临床免疫干预治疗奠定基础。

HSPgp96体外诱导腹腔巨噬细胞抗肿瘤细胞毒作用

目的：探讨HSPgp96对小鼠PEMφ体外抗肿瘤细胞毒作用的影响。方法：分离巯基乙酸盐诱导的小鼠PEMφ,随机分为培养液对照组、LPS诱导组、HSPgp96诱导组。应用硝酸还原酶法、MTT法、扫描电镜分别观测PEMφNO的生成、对肝癌细胞H22的细胞毒作用及形态学变化。结果：在HSPgp96的体外诱导下,小鼠PEMφNO的生成量显著增加,对肝癌细胞H22的细胞毒作用明显增强,其效应与LPS相当。结论：HSPgp96可在体外有效激活PEM中的抗肿瘤细胞毒作用,NO是PEMφ杀瘤机制中的重要效应分子之一。

胃癌组织gp96表达的临床意义

目的:探讨gp96在人胃癌组织及癌旁正常组织中的表达及其临床意义. 方法:采用原位杂交技术和SABC免疫组化法,在核酸和蛋白水平检测胃癌组织(n=50)及癌旁正常组织(n=50)gp96 的表达. 结果:胃癌组织及癌旁正常组织均可检测到gp96的表达, 胃癌组织gp96的表达均显著高于其癌旁正常组织(强阳性: 18/50 vs 0/50,P<0.01).gp96的表达与组织学类型显著相关(r=0.387,P<0.05),不同分化程度的胃癌组织之间, gp96的表达存在显著差异(P<0.05);与肿瘤分期显著相关(r=0.203,P<0.05),临床Ⅲ,Ⅳ期显著高于Ⅰ,Ⅱ期(强阳性:13/50 vs 5/50,P<0.05);与淋巴结转移显著相关(r=0.391,P<0.05),有淋巴结转移者显著高于无淋巴结转移者(强阳性:14/50 vs 4/50,P<0.05);而gp96表达与性别、年龄及肿瘤部位无显著相关. 结论:gp96的表达与胃癌的发生、发展密切相关,其表达水平可以作为判断胃癌预后的参考指标之一.