PAS-ELISA检测GFLV和GLRaV-3技术的研究

以中国农业科学院郑州果树研究所国家葡萄资源圃的葡萄品种为试材,对葡萄扇叶病毒(GFLV)和葡萄卷叶病毒Ⅲ(GLRaV-3)进行了A蛋白酶联免疫吸附测定(PAS-ELISA)的检测技术的研究。从阴、阳性对照及抗血清或抗体浓度的选择,到不同时期、检测部位对结果的影响,建立了一套完整的ELISA检测GFLV和GLRaV-3程序;通过试验分析,该方法快速,简便,经济且灵敏度高,不失为葡萄病毒检测的一种新方法。通过检测,还了解到GFLV的发病高峰在春季,主要发病部位在上部叶片,而GLRaV-3的发病高峰在秋季,重要发病部位在下部叶片。

三种ELISA方法检测葡萄卷叶病毒(GLRaV)和扇叶病毒(GFLV)的比较

检测是认识一种病害最基本的前提,通过对三种ELISA检测GLRaV和GFLV的比较认为,双抗夹心-ELISA(DAS-ELISA)、间接-ELISA(PTA-ELISA)和A蛋白夹心-ELISA(PAS-ELISA) 都能检测GLRaV和GFLV。DAS-ELISA能缩短检测的时间,然而这项技术具有较高的株系特异性,在检测中可能产生假阴性反应,因此,必要时可用PTA-ELISA和PAS-ELISA对一些关键样品进行复检。

我国葡萄扇叶衰退病相关病毒研究进展

葡萄扇叶衰退病(grapevine fanleaf degeneration disease,GFDD)是葡萄栽培中常见的病毒病害,在我国葡萄产区发生普遍,危害严重。引起该病的病毒种类有10余种,症状表现受葡萄品种、病毒种类、栽培条件等多种因素影响。由于高通量测序技术的发展与应用,我国鉴定发现了除葡萄扇叶病毒(grapevine fanleaf virus,GFLV)之外的3种GFDD相关病毒,即葡萄浆果内坏死病毒(grapevine berry inner necrosis virus,GINV)、灰比诺葡萄病毒(grapevine Pinot gris virus,GPGV)和葡萄蚕豆萎蔫病毒(grapevine fabavirus,GFabV)。系统综述了我国GFDD的主要病原及其侵染状况,可为该病害的精准防控提供参考。

葡萄扇叶病毒移动蛋白在寄主体内的动态检测和免疫金标记

利用葡萄扇叶病毒法国分离物F1 3 (Grapenivefanleafvirus,GFLV F1 3 )移动蛋白抗体对杭州分离物 (GFLV H)移动蛋白进行Westernblot,分析表明移动蛋白在接种GFLV H 3d后的苋色藜 (Chenopodiumamaranticolor)系统叶中就可检测到 ,随着时间推移 ,其积累量逐渐升高 ,接种 1 6d后达到最高值。接种 3 2d后的病叶已经枯黄 ,但移动蛋白积累量并没有减少。超薄切片电镜观察发现 ,在感染GFLV H的昆诺藜 (C .quinoa)和苋色藜的叶肉组织薄壁细胞中 ,病毒粒子呈纵列整齐地排列在小管状结构中 ,在胞间连丝中也发现有管状结构。免疫金标记显示胶体金能定位在细胞质、细胞壁和胞间连丝上 ,在管状结构也发现有少量的金粒子。

葡萄扇叶病毒外壳蛋白基因的克隆,序列分析及其在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR方法把葡萄扇叶病毒(GFLV)外壳蛋白基因(CP gene)分成两部分扩增,扩增产物克隆入pGEM-5Zf(+)载体,并通过BglⅢ位点连接成一完整的外壳蛋白基因,通过序列分析测得全长外壳蛋白基因为1512bp,编码504个AA＇s,与国外株系GFLV-F13相比,核苷酸同源性为88.4％,氨基酸同源性为95.8％。并且这一外壳蛋白基因在大肠杆菌E.coli DH-5α中得到了表达。

北京地区葡萄扇叶病毒检测

采用酶联免疫吸附技术（ＥＬＩＳＡ）（Ａ－蛋白夹心法）对北京地区的葡萄品种进行扇叶病毒（ｆａｎｌｅａｆｖｉｒｕｓ）的测定。结果表明，北京地区葡萄品种普遍感染扇叶病毒且带毒情况较为严重。

葡萄扇叶病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

根据葡萄扇叶病毒(Grapevine fanleaf virus,GFLV)RNA2序列设计4对特异性引物,通过引物筛选、体系优化,建立了以FL-HP1-F/R为引物的GFLV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法。该方法标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为100%,相关性系数为0.998,灵敏性分别是常规RT-PCR和巢式RT-PCR的100倍和10倍。重复性试验表明组内和组间变异系数均小于2.59%,显示该方法具有较好的检测稳定性。内参基因的稳定性测试结果表明葡萄EF1和GAPDH基因具有较好的试验稳定性。利用建立的荧光定量方法测定12个葡萄样品中GFLV含量,并检测58个葡萄样品,结果表明不同葡萄样品中GFLV含量差异较大,最高含量是最低含量的81 245.5倍,与ELISA和巢式RT-PCR相比,实时荧光定量方法能检测出更多的GFLV分离物。