人B7-2和增强型绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建

目的 构建含人B7- 2与增强型绿色荧光蛋白融合基因表达载体p EGFP- N3- B7- 2。方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)方法从重症肌无力患者胸腺组织中扩增到人B7- 2 c DNA基因片段,经回收、纯化、酶切后,依次连接到质粒p GEM- Teasy和p EGFP- N3上。结果 通过酶切和序列分析证实插入片段序列正确。结论 应用基因工程技术构建成功p EGFP- N3- B7- 2融合基因表达载体,为增强型绿色荧光蛋白作为人B7- 2生物标记分子,转染肿瘤细胞及树突状细胞制备疫苗奠定了基础。

葡聚糖磁性纳米颗粒在基因转染中的应用

目的:评价葡聚糖磁性纳米颗粒作为基因载体在体外转染中的可行性。方法:用紫外分光光度计及琼脂糖凝胶电泳法分析检测葡聚糖磁性纳米颗粒结合DNA的能力,再将葡聚糖磁性纳米颗粒作为基因载体连接绿色荧光蛋白pEGFP-C1质粒报告基因在体外转染人膀胱肿瘤细胞BIU87和人树突状细胞,并在转染后72 h采用MTT比色法测定这种载体对细胞增殖和功能的影响以了解其细胞毒性。结果:在葡聚糖磁性纳米颗粒表面修饰多聚赖氨酸后,以静电引力作用结合DNA,其DNA结合率可达到75.6%,修饰多聚赖氨酸的葡聚糖磁性纳米颗粒可作为基因载体将报告基因转染至各类型细胞内并成功表达,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光细胞。与相同条件下脂质体为对照,转染后的细胞增殖活性及功能略优于对照组,有效地证明了葡聚糖磁性纳米颗粒的细胞毒性稍低于脂质体的细胞毒性。结论:葡聚糖磁性纳米颗粒可作为有效的基因载体之一。

功能化Fe_3O_4的制备及在基因转染中的应用

目的探讨修饰了多聚赖氨酸的超顺磁性葡聚糖Fe3O4纳米粒子(简称功能化Fe3O4,DMNP)的制备及其作为基因载体的可行性。方法采用碱沉淀法一步合成了外包葡聚糖的磁性纳米粒子,并用多聚赖氨酸对其表面进行修饰,使之通过静电作用吸附连接DNA。同时应用扫描电镜、红外分光光度计对该纳米复合物的结构及成分进行表征,并用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计对其结合质粒DNA的能力进行测量,该复合纳米粒子作为基因载体将绿色荧光蛋白质粒pEGFP-C1转入人肺癌细胞系A549中,并进一步将载肺癌耐药基因ABCG2-PCDNA3.1质粒转入人肺癌细胞系A549中。结果该复合纳米粒子分散性好,大小较均一,与质粒DNA有较好的结合能力,用荧光显微镜观察到了绿色荧光蛋白的表达,并用PCR技术检测到了耐药基因ABCG2的表达。结论该复合纳米粒子能作为一种新型有效的基因载体在体外将载肺癌耐药基因ABCG2-PCDNA3.1质粒转入人肺癌细胞系A549中并表达。

磁性氧化铁纳米颗粒与脂质体介导EGFP基因转染内皮祖细胞的比较研究

目的评价精氨酸包裹的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(nano-Fe2O3-arginine)及脂质体作为基因载体在针对外周血来源的内皮祖细胞转染中的可行性,并对两者的转染效率进行比较。方法将nano-Fe2O3-arginine及LipofectamineTM2000作为基因载体连接绿色荧光蛋白pcDNA3.1(+)/EGFP质粒在体外转染兔外周血来源的内皮祖细胞,荧光显微镜观察转染结果并计算转染效率;转染后48h采用MTT比色法测定这两种载体对内皮祖细胞增殖和功能的影响以了解其细胞毒性。结果LipofectamineTM2000作为基因载体将报告基因转染至兔外周血内皮祖细胞内并成功表达,用荧光显微镜可观察到发绿色荧光的细胞,转染效率达38.3%;而nano-Fe2O3-arginine转染组在荧光显微镜仅能观察到少量绿色荧光细胞,转染效率不到5%;两种载体对内皮祖细胞的增殖活性未见明显影响。结论脂质体作为载体转染内皮祖细胞的效率明显高于精氨酸包裹的超顺磁性氧化铁纳米颗粒,脂质体可较为有效安全地转染基因至内皮祖细胞,从而为内皮祖细胞联合基因治疗疾病奠定了基础。

新型纳米转染试剂转染PNP自杀基因体外杀伤实验

将壳聚糖纳米粒包裹的报告基因pEGFP-N1质粒转染至HEK293细胞,并在HEK293细胞中成功表达荧光蛋白的基础上,进一步将本室自行构建的PNP基因的真核高效表达载体质粒pcDNA3-PNP转染至HEK293细胞。转染72h后,对转染的HEK293细胞给予前体药6-MPDR至终浓度40μg/ml,一天后,采用MTT比色法测定药物对细胞增值的影响,并进行统计学处理。实验结果表明采用壳聚糖纳米粒转染试剂转染并给予前体药6-MPDR的实验组活细胞数,与用壳聚糖转染但不给前体药6-MPDR的对照组活细胞数相比,有显著差异(P<0.05),说明新筛选出的壳聚糖纳米粒转染试剂可以将PNP自杀基因递送至靶细胞中,并在细胞中进行表达,从而使PNP/6-MPDR自杀基因系统发挥杀伤细胞的作用。分别采用相同工作浓度的脂质体与壳聚糖纳米粒转染试剂转染相同浓度的基因质粒,壳聚糖纳米粒对靶细胞生长数量影响很小,说明的壳聚糖纳米粒细胞毒性大大低于阳离子脂质体的细胞毒性。

含绿色荧光蛋白和小鼠T—bet基因双顺反子真核表达载体的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建一种带有绿色荧光蛋白（GFP）和小鼠T—bet基因双顺反子的新型真核表达载体pCI—mT—bet—IRES—GFP。方法利用脑炎心肌炎病毒（EMCV）的内部核糖体进入位点（IRES），将GFP的cDNA与小鼠T—bet基因（mT—bet）连接到真核表达载体pCI中，构建含GFP和mT—bet基因双顺反子的重组质粒。结果成功构建了含GFP和mT—bet基因双顺反子的真核表达载体。荧光显微镜下可观察到发绿色荧光的转基因细胞。结论含绿色荧光蛋白和mT—bet基因双顺反子真核表达载体的构建为哮喘基因治疗研究提供了新的生物表达体系。

葡聚糖磁性纳米颗粒在基因转染人树突状细胞中的研究

目的评价葡聚糖磁性纳米颗粒作为基因载体在针对人树突状细胞转染中的可行性。方法用紫外分光光度计及琼脂糖凝胶电泳法分析检测葡聚糖磁性纳米颗粒结合DNA的能力,再将葡聚糖磁性纳米颗粒作为基因载体连接绿色荧光蛋白pEGFPC1质粒报告基因在体外转染人树突状细胞,并在转染后72h采用MTT比色法测定这种载体对人树突状细胞增殖和功能的影响以了解其细胞毒性。结果在葡聚糖磁性纳米颗粒表面修饰多聚赖氨酸后,以静电引力作用结合DNA,其DNA结合率可达到75.6%,修饰多聚赖氨酸的葡聚糖磁性纳米颗粒可作为基因载体将报告基因转染至人树突状细胞内并成功表达,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光细胞。与相同条件下脂质体为对照,转染后的人树突状细胞的增殖活性及功能略优于对照组,有效的证明了葡聚糖磁性纳米颗粒的细胞毒性稍低于脂质体的细胞毒性。结论葡聚糖磁性纳米颗粒可作为有效转染人树突状细胞的基因载体之一。