结核分枝杆菌GroEL1蛋白表达、纯化及结构和功能的生物信息学分析

目的:应用基因工程技术和生物信息学方法对结核分枝杆菌GroEL1进行原核表达与纯化及其结构和功能预测,分析该抗原在新型结核疫苗的应用价值。方法:采用PCR技术体外扩增GroEL1基因,并克隆至pET28a质粒中,测序筛选构建成功的pET28a-GroEL1载体,将其载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中,IPTG诱导表达重组GroEL1蛋白,利用镍亲和层析柱纯化。从UniProt数据库中获取H37Ra株GroEL1核苷酸和氨基酸序列;分别运用Protparam、TMHMM-2.0、Protscale、NetChop-3.1、Psortb、SignalP-4.1工具预测GroEL1蛋白的理化性质、跨膜螺旋、亲/疏水性、磷酸化位点、亚细胞定位,信号肽;NetNGlyc-1.0和YinOYang-1.2预测其糖基化位点;SOPMA和Swissmodel预测蛋白的二级结构和三级结构;Clustalw对同源序列进行比对。String预测相互作用蛋白,IEBD和ABCpred预测蛋白的B细胞抗原表位。结果:成功构建重组pET28a-GroEL1载体,GroEL1蛋白在大肠杆菌中部分以可溶形式表达。镍亲和层析柱纯化重组GroEL1蛋白,其纯度达90%以上。Western blot鉴定证实重组GroEL1蛋白具有良好的免疫反应性。结核分枝杆菌H37Ra株GroEL1基因全长1620 bp,编码539个氨基酸,分子量55.88 kD,等电点为4.98,预测显示该蛋白亲水性较强、性质稳定,无跨膜区,有37个可能的磷酸化修饰位点和8个O-糖基化位点,属于非分泌蛋白,定位在细胞质,二级结构显示α-螺旋占53.43%,延伸链占11.87%,β-转角占7.61%,无规则卷曲占27.09%,有多个B细胞抗原表位及多个与GroEL1蛋白相互作用蛋白。结论:成功表达并纯化重组GroEL1蛋白,运用生物信息学成功预测GroEL1蛋白的结构和功能,为结核病的预防、诊断和治疗奠定基础。

基于groEL基因检测云南家鼠鼠疫疫源地鼠类动物感染米库尔新埃立克体情况

目的调查云南家鼠鼠疫疫源地鼠类动物感染米库尔新埃立克体情况。方法以云南省梁河县、芒市和弥勒市鼠疫疫源地为采样点,使用夹夜法捕捉鼠类动物,并收集脾脏样本。采用巢式PCR技术检测脾脏样本中米库尔新埃立克体特异性groEL基因,并对阳性产物进行Sanger双向序列测定。应用χ2检验或Fisher确切概率法分析不同疫源地、生境、鼠种、性别间鼠类动物感染米库尔新埃立克体的情况。结果检测656份鼠类动物样本,在黄胸鼠、斯氏家鼠、北社鼠和青毛巨鼠上检出米库尔新埃立克体阳性12份,阳性率为1.83%。不同疫源地、生境、鼠种、性别间鼠类动物感染米库尔新埃立克体的阳性率均无统计学差异(P>0.05)。基于groEL基因的遗传进化分析,12份阳性样本核酸序列内部的同源性在99.5%~100%,米库尔新埃立克体核酸序列处于同一分支,为ClusterⅣ型。结论云南家鼠鼠疫疫源地4种鼠类动物存在米库尔新埃立克体低度感染。

钩端螺旋体groEL基因原核表达及其产物免疫保护作用

目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)黄疸出血群赖型赖株groEL基因原核重组表达系统,了解重组表达的GroEL蛋白(rGroEL)对金地鼠的免疫保护作用。方法:采用高保真PCR扩增问号钩体赖株groEL基因并测序,常规方法构建groEL基因原核表达系统。采用SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图像分析系统检查rGroEL表达情况及其可溶性,Ni-NTA亲和层析法提纯rGroEL。观察rGroEL免疫金地鼠对问号钩体赖株感染的保护率。采用MAT法检测免疫动物血清与我国流行问号钩体血清群交叉凝集效价。结果:所克隆的groEL基因核苷酸和氨基酸序列与GenBank中相应基因完全相同。所构建的groEL基因原核表达系统能表达可溶性rGroEL。100和200μgrGroEL对金地鼠的免疫保护率分别为50.0%和75.0%。rGroEL免疫金地鼠血清可不同程度地凝集各问号钩体血清群。结论:GroEL蛋白是问号钩体属特异性保护性抗原,可用于制备通用性钩体基因工程疫苗。

烟草转GroEL基因抗双生病毒的研究

双生病毒是全球性的重要植物病毒,为提高植物对此病毒的抗性,分离了烟粉虱体内GroEL基因,将其连接到棉花韧皮部特异启动子PGHNBS下游,构建到植物表达载体PBI121上,采用农杆菌介导法转化烟草,获得抗性苗。对抗性植株进行PCR、RT-PCR和病毒侵染检测,结果表明:GroEL基因已经整合到烟草基因组中,并且在转录水平上表达。病毒侵染检测结果显示转基因烟草植株中没有检测到病毒,证明韧皮部特异表达GroEL基因抗双生病毒是可行的。

基于GroEL基因的实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体方法的建立及评价

目的建立一种敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,用于检测临床标本中的恙虫病东方体。方法根据恙虫病东方体GroEL蛋白基因序列设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法。并从灵敏度、特异度、重复性及临床标本的检测能力等方面对本方法进行综合评价。结果建立的实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性,可检测出恙虫病东方体Gilliam、Karp、Kato和Kawasaki株。建立的标准曲线循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈现良好的线性关系(r=0.99),灵敏度分析显示样品最低检出浓度为21.8拷贝/μL。批内及批间重复性实验变异系数均小于1.5%,显示本方法具有良好的重复性。对本实验室保存的82份临床标本进行检测,并与常规巢式PCR方法比较,本方法检测出26份阳性标本中的25份,检出率为96.15%。结论本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有较高的敏感性、特异性和稳定性,可用于临床病人及暴发疫情的实验室快速检测。

烟粉虱内共生菌groEL基因的原核表达条件研究

为了获得较多的GroEL蛋白,深入研究其性质,对烟粉虱内共生菌groEL基因表达的条件进行了研究.结果表明:诱导groEL基因原核表达的最佳IPTG浓度为100μmol/L;在35℃诱导培养,能够获得较高的蛋白表达量;最佳诱导培养时间为4～5h;最佳诱导培养的初始pH值为8.0;在振荡转速为120r/min、诱导培养时间为4～5h时,增大接种量,有利于原核基因的表达;添加少量的NH4+有利于提高groEL基因原核表达的量,但Ca2+、Fe3+、K+、Mg2+则抑制groEL基因的原核表达,其中Fe3+抑制作用最为强烈;NH4+含量过高也不利于groEL基因原核表达;在培养基中添加少量的葡萄糖,能够提高groEL基因原核表达,但葡萄糖含量较高时不利于groEL基因原核表达.

牛型布氏杆菌GroEL的克隆表达及其生物学特性研究

根据已发表的牛型布氏杆菌(Brucella abrotus)基因序列设计一对特异性引物,以B.abrotusA19株基因组为模板,通过PCR扩增GroEL基因,经T-A克隆后进行序列测定和分析。结果表明,GroEL基因全长1 641bp,编码546个氨基酸。将GroEL定向克隆至表达载体pET32a中,构建重组表达质粒pET32a-LGroEL,然后转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下成功获得重组表达蛋白His-GroEL,大小为81 kDa。经Western blot检测,牛布氏杆菌阳性血清中有GroEL抗体存在,表明该蛋白具有免疫原性。对重组表达蛋白His-GroEL进行酶促活性检测,结果表明该蛋白在体外具有催化ATP水解的酶活性和促进乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)复性的功能。

新疆绵羊种布鲁氏菌GroEL基因的克隆及序列分析

参考牛种布鲁氏菌的GroEL(热休克蛋白)基因设计引物,扩增出新疆绵羊种布鲁氏菌GroEL基因片段,将其片段克隆到T载体上测序。结果表明:新疆源布鲁氏菌GroEL基因片段长1641bp,编码546个氨基酸,与羊种(B.melitensis)、猪种(B.suis)以及牛种(B.abortus)GroEL基因的核苷酸序列同源性分别为99.88%、99.82%、99.88%,推导的氨基酸序列同源性在99%以上,显示了很强的保守性。

玉米蚜体内参与传毒的共生菌groEL基因的克隆和原核表达

以玉米蚜杨凌生物型为材料,设计特异性引物采用PCR的方法在国内首先克隆了一种玉米蚜体内参与传毒的共生菌groEL基因,序列测定结果表明:玉米蚜杨凌生物型共生菌groEL基因全长为1647bp.编码548个氨基酸,登录Genebank,序列号为AF387863。构建了该基因的原核表达载体,用pBV221表达出63KDa的非融合目的蛋白,用pET-30a表达出69KDa的融合蛋白,二者均有较高的表达量。

灰飞虱体内共生菌Wolbachia的groEL基因克隆及序列分析

利用特异性引物,首次在国内克隆获得灰飞虱(Laodelphax striatellusFalln)体内共生菌Wolbachia的groEL基因全长序列,其开放阅读框为1659bp,可编码552个氨基酸,GenBank登录号为:EF468716,与已发布的韩国分离物核苷酸一致性达99.9%,为进一步研究其与灰飞虱传播水稻条纹病毒的关系奠定了基础.

烟粉虱内共生菌传毒相关groEL基因的克隆及其原核表达

烟粉虱内共生菌 groEL基因编码一种 6 3kD的GroEL蛋白 ,利用一对特异性引物 ,通过PCR对长期培养在黄瓜上的烟粉虱体内 groEL基因进行了扩增 ,序列测定表明其长度为 16 6 8bp ,编码 5 5 5个氨基酸 ,与GenBank中烟粉虱内共生菌 groEL(AF130 4 2 1)的核苷酸同源性为 99.5 8%,仅 7个核苷酸发生了变异 ,二者氨基酸序列同源性为 99.2 8%,仅 4个氨基酸有别。构建了一个原核表达载体 ,表达得到了

抗大肠杆菌分子伴侣GroEL单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备抗大肠杆菌分子伴侣GroEL的单克隆抗体。方法超声裂解制备大肠杆菌DH5α菌体蛋白,免疫小鼠后用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。采用免疫沉淀方法分离大肠杆菌菌体蛋白中的目的条带,通过质谱分析,鉴定目的蛋白为GroEL。结果菌体蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体33株,其中单克隆抗体1A5免疫沉淀得到的蛋白,经质谱鉴定为大肠杆菌分子伴侣GroEL。结论成功制备抗大肠杆菌分子伴侣GroEL分子的单克隆抗体,为进一步研究分子伴侣GroEL的结构和功能提供了新的手段。

分子伴侣GroEL促进溶菌酶复性动力学

建立了溶菌酶复性的表观动力学模型 ,研究了分子伴侣GroEL促进变性溶菌酶复性的动力学行为 ,包括酶浓度、三磷酸腺苷 (ATP)浓度、GroEL与酶的摩尔比对复性率和复性速率常数的影响 .酶浓度对复性速率常数的影响比对复性率的影响显著 ;酶的复性率和复性速率常数随ATP浓度的增大而提高 ;在蛋白质浓度一定的情况下 ,存在适宜的GroEL和ATP浓度 。

不同寄主植物的烟粉虱(Bemisia tabaci)内共生菌传毒相关GroEL蛋白的一致性

通过对7种寄主植物上B型烟粉虱北京种群的内共生菌传毒相关groEL基因进行PCR扩增和测序,结合已有的相关序列,构建了groEL基因及其编码的GroEL蛋白的分子系统树。结果表明:烟粉虱内共生菌产生的groEL基因是一个非常保守的基因,北京不同寄主植物的烟粉虱内共生菌与IsraelB型烟粉虱内共生菌的groEL基因亲源关系非常近,位于同一进化分支,其编码的GroEL蛋白的分子系统树也基本上是一致的。不同物种的groEL基因及其编码的GroEL蛋白分别位于不同的分支,说明groEL基因及其编码的GroEL蛋白的分子系统树可以用于分析物种间的进化关系。氨基酸序列比较表明:烟粉虱内共生菌GroEL具有原核GroEL的保守氨基酸、ATP酶活性位点、多肽结合位点和GroES连接位点,为典型的hsp60。不同来源烟粉虱内共生菌GroEL有少数几个保守氨基酸发生了置换,可能不是GroEL功能的重要位点。说明在容易变异的细菌基因组中,groEL基因为了维持其正常重要的生理功能,会通过保持功能位点的稳定性来应对不同生态因素的影响。

烟粉虱内共生菌groEL基因的PCR扩增与测序

烟粉虱内共生菌groEL基因编码一种 63KD的GroEL蛋白 ,属于分子伴侣cpn60家族成员 ,与烟粉虱传播植物病毒病关系密切。通过PCR对长期生活在甘蓝上的烟粉虱体内groEL基因进行了PCR扩增 ,序列测定表明其长度为 1 668bp ,编码 5 5 5个氨基酸 ,与Genebank中烟粉虱内共生菌groEL(AF1 30 4 2 1 )的核苷酸同源性为 99 82 % ,氨基酸同源性为 99 64%。

烟粉虱内共生菌传毒相关groEL基因dsRNA载体的构建及其在烟草中的表达

烟粉虱内共生菌groEL基因编码一种与植物病毒传毒相关的GroEL蛋白.以B型烟粉虱为研究对象,利用1对特异引物,对B型烟粉虱体内的groEL基因进行PCR扩增,选取502 bp groEL基因片段构建dsRNA,并将其连接植物表达载体pBIN19,将重组质粒电激转化农杆菌菌株LBA4404.采用农杆菌浸染转化本氏烟草,PCR筛选表明,目的片段已整合至转基因植株的基因组DNA;RT-PCR结果表明,502 bp的groEL基因片段在转基因植株中被转录.

新疆绵羊种布鲁氏菌HtrA基因与GroEL基因的克隆及其原核表达

根据已发表的牛流产型布鲁氏菌HtrA(High temperature requirment A)基因、GroEL(热休克蛋白)基因设计特异性引物,从新疆绵羊种布鲁氏菌基因组中扩增出HtrA、GroEL基因片段,将HtrA、GroEL基因片段纯化后分别克隆到T载体上测序,结果表明新疆绵羊种布鲁氏菌HtrA基因片段长1542 bp,编码513个氨基酸,与发表的牛种(B.abortus)、羊种(B.melitensis)、猪种(B.suis)的HtrA基因序列的同源性分别为99.68%、99.81%、99.55%。GroEL基因片段长1641 bp,编码546个氨基酸,与B.melitensis、B.suis以及B.abortus GroEL基因的核苷酸序列同源性分别为99.88%、99.82%、99.88%。HtrA基因和GroEL基因与发表的B.abortus、B.melitensis、B.suis的HtrA基因和GroEL基因序列的具有很高的同源性。按正确的阅读框架分别将两基因片段定向克隆到表达载体pET-28a上,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和western blot分析表明,HtrA、GroEL基因能在大肠杆菌中成功表达,表达的蛋白分子量都约为60 Ku,并能和布鲁氏菌免疫兔子产生的抗体发生特异性的结合。

分子伴侣GroEL对青霉素G酰化酶亚基折叠的影响

采用 Tac启动子控制表达质粒 ,在不同的宿主细胞中表达了青霉素 G酰化酶 ( PAC)。检测这些菌株所表达的 PAC活性 ,分析细胞内分子伴侣 Gro EL含量、PAC翻译后加工为 α、β亚基的状况 ,以及它们之间的关系。结果表明 :质粒 p KK- SP在不同宿主中表达时 ,翻译后加工状况有明显差异 ,单位质量细胞所表达的 PAC活性与翻译后加工效率相关 ,且与细胞内分子伴侣 Gro EL在菌体总蛋白中含量正相关。同时也阐明了亚基的折叠成为翻译后加工过程的限制步骤 ,细胞内分子伴侣 Gro EL有助于

灰飞虱共生菌groEL基因的克隆、生物信息学分析及其植物双元表达载体构建

本研究克隆了江苏南京地区灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallén)体内共生菌Wolbachia的groEL基因全长序列。序列分析表明,其开放阅读框为1659bp,编码552个氨基酸残基,分子量为58.884kD,等电点为5.01。序列比对发现克隆的groEL基因与已登录的groEL基因(登录号:EF468716)起始密码子下游424bp处存在一个核苷酸的差异,与另一groEL基因(登录号:DQ356890)完全一致。利用PROTEIN DATA BANK在线软件对灰飞虱的groEL蛋白立体结构进行预测,结果表明灰飞虱的groEL蛋白为同型寡聚复合物,具有分子伴侣功能。本研究进一步构建了含该groEL基因和潮霉素基因的双元表达载体,为下一步转化水稻奠定了基础。

沙门菌grOEL基因序列在系统发育分析和PCR-限制性片段多态性分析鉴定中的应用

目的探讨grOEL基因序列在沙门菌进化分析和分型鉴定中的应用。方法对8种血清群的沙门菌菌株进行PCR扩增、测序,然后用分子生物学软件Bioedit与DNAstar进行序列分析,同时用PCR-限制性片段多态性分析(RFLP)技术进行分型鉴定。结果8种沙门菌血清群grOEL基因保守序列与变异序列呈锯齿状排列,其grOEL氨基酸系统发育树与grOEL基因系统发育树结果不完全相同,但O8、O9、O10之间亲缘关系最近,PCR-RFLP分析有5种模式图。结论grOEL基因序列在沙门菌系统发育中可作为遗传标记,同时也可作为分型鉴定的靶序列。