户尘螨Ⅱ类变应原Der p2 T细胞表位融合基因的克隆和原核表达

目的 原核表达、纯化户尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus）主要变应原Der p2的T细胞表位融合肽。 方法 将已报道的户尘螨Der p2中编码4个T细胞表位（T1-T4）的核苷酸序列以T1-T2-T3-T4的方式连接，人工合成为嵌合基因，命名为Der p2 T。PCR扩增目的基因Der p2 T，将纯化的扩增片段克隆至pET-28a（＋）载体，构建原核重组表达质粒pET-28a（＋）-Der p2 T，并进行双酶切验证。大量诱导表达含pET-28a（＋）-Der p2 T的E. coli BL-21菌株，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，经Ni-NTA亲和层析获得纯化重组蛋白，并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析。ELISA法检测重组Der p2 T细胞表位融合肽对户尘螨过敏患者血清IgE抗体的结合能力。 结果 双酶切结果表明，构建了原核重组表达质粒pET-28a（＋）-Der p2 T。SDS-PAGE分析结果显示，获得相对分子质量（Mr）为10 000的重组Der p2 T细胞表位融合肽。Western blotting分析结果显示，纯化了Der p2的T细胞表位融合肽。Der p2 T细胞表位融合肽对粉尘螨哮喘患者的血清IgE结合能力［（37.70±9.89）μg/ml］较Der p2显著降低［（85.89±9.63）μg/ml］（P＜0.01）。 结论 制备Der p2 T细胞表位融合肽。与Der p2相比，重组Der p2 T细胞表位融合肽对户尘螨过敏患者血清IgE抗体的结合能力明显降低。

粉尘螨变应原第2组分血清特异性IgE酶联免疫吸附测定法的建立及其检测效能的评价

目的建立粉尘螨变应原第2组分(Der f 2)血清特异性IgE的酶联免疫吸附测定(ELISA)法,并评价其检测效能。方法利用重组表达的Der f 2作为包被抗原,分别建立检测Der f 2血清特异性IgE的间接ELISA法和亲和素-生物素复合(ABC)-ELISA法,采用正交试验筛选两种方法的最优检测条件。分别采用上述两种ELISA法检测Der f 2特异性IgE阳性标准血清,绘制两种ELISA法检测Der f 2特异性IgE的标准曲线;同时以Pharmacia Uni Cap系统检测结果为金标准,计算两种ELISA法检测46例哮喘患者血清Der f 2特异性IgE的结果符合率。结果间接ELISA法检测Der f 2特异性IgE的最佳条件为:包被液浓度为10μg/ml,血清稀释倍数为1∶5,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗人IgE抗体稀释倍数为1∶1 000。ABC-ELISA法检测Der f 2特异性IgE的最佳条件为:包被液浓度为15μg/ml,血清稀释倍数为1∶5,生物素标记抗人IgE抗体稀释倍数为1∶1 000,HRP标记的链霉和素稀释倍数为1∶2 000。间接ELISA和ABC-ELISA法的灵敏度值分别为0. 72 U/ml和0. 69 U/ml。间接ELISA和ABC-ELISA检测哮喘患者的符合率分别为93. 5%和95. 7%。结论成功建立基于重组表达Der f 2的ELISA法,其对Der f 2特异性IgE具有较好的检测效能。

重组粉尘螨变应原第2组分的研究概况

尘螨是最常见的室内变应原来源之一，约80％以上尘螨过敏性疾病患者血清螨特异性IgE可与尘螨变应原第2组分结合。粉尘螨变应原第2组分Derf2为螨体的组织成分，被认为是诱导哮喘与变态反应性疾病的最重要变应原之一。近年来，变态反应性疾病的发病率呈现逐年增高的趋势，而重组变应原在过敏性疾病诊断和治疗中具有独特的优势和前景，故正日益成为此领域中研究的热点之一。该文就Derf2的生物学特征、重组变应原的制备、免疫学效果及其在特异性免疫诊治中的应用前景予以综述。

重组粉尘螨Ⅱ类变应原致敏小鼠肺部变应性炎症模型的建立

目的探讨以重组粉尘螨Ⅱ类变应原(rDerf2)建立小鼠肺部变应性炎症模型的方法。方法将30只6～8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠,随机分为PBS组(阴性对照组)、卵清蛋白(OVA)组(阳性对照组)和rDerf2组(实验组)。实验组分别于第0、7、14天用rDerf2对小鼠腹腔进行注射致敏;再于第21天开始,连续7d进行雾化激发;对照组分别用PBS和OVA代替。最后一次雾化激发后24h内处死动物,观察肺组织病理变化、支气管肺泡灌洗液(BLAF)中的白细胞计数及分类,用ELISA测定BLAF和脾细胞培养上清中白细胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-17和IFN-γ的含量及血清中IgG1、IgE抗体水平变化。结果实验组和阳性对照组BALB/c小鼠肺组织呈现明显的炎症性病理改变;rDerf2组的BALF中白细胞总数〔(17.39±1.03)×106/L〕及嗜酸性粒细胞(EOS)〔(1.61±0.03)×106/L〕计数,均明显高于PBS组(P<0.01);BALF中IL-4〔(78.92±9.06)pg/ml〕、IL-17〔(201.63±31.26)pg/ml〕与PBS组比较呈明显的高水平表达(P<0.01);而IL-2〔(8.29±1.27)pg/ml〕和IFN-γ〔(51.04±15.85)pg/ml〕的含量则显著下降(P<0.01);上述指标在脾细胞培养上清中出现类似的变化。rDerf2组血清中IgE〔(37.63±6.57)IU/ml〕、IgG1〔(16.68±2.90)μg/ml〕的含量表现为Th2型反应增强趋势;但OVA组和rDerf2组间所有指标差异均无统计学意义(P>0.05)。结论用rDerf2腹腔注射致敏后再雾化激发的方式能够成功构建小鼠肺部变应性炎症模型。

重组粉尘螨Ⅱ类变应原的原核表达及纯化

目的表达并纯化粉尘螨2类变应原Der f 2蛋白,检测其变应原性。方法用1mmol/L的IPTG诱导含重组质粒pET30a-Der f2的大肠埃希菌BL21(DE3),SDS-PAGE电泳检测并纯化目的蛋白,ELISA检测其与尘螨哮喘患者血清IgE的结合活性。结果 SDS-PAGE电泳检测重组质粒pET30a-Der f 2表达产物,其分子质量单位为15ku,与预期大小相符。ELISA检测纯化的Der f 2蛋白可与尘螨哮喘患者血清IgE反应。结论成功获得并纯化了Der f2重组蛋白,该蛋白具有变应原性,为进行尘螨过敏性疾病的变应原特异性免疫治疗的动物实验奠定了物质基础。