细粒棘球蚴2HSP70重组质粒的构建、原核表达、纯化和初步鉴定

目的构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,EG)2热休克蛋白70(heat shock protein,2HSP70)表达重组质粒,原核表达及纯化重组蛋白,并对重组蛋白进行免疫学特性的初步鉴定。方法从EG2HSP70/pGEM-T/JM109质粒中分离EG2HSP70目的基因,将此片段重组入表达载体pGEX-6P-1后转化入大肠杆菌BL21,鉴定后以IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE检测其表达水平,用亲和层析纯化并分离重组蛋白,利用Western blot来鉴定重组蛋白的免疫学特性。结果酶切鉴定及测序分析表明,成功构建细粒棘球蚴pGEX-6P-1/EG2HSP70重组质粒;IPTG诱导表达后,融合蛋白占菌体总蛋白的39%,占裂解物上清总蛋白的70.4%,表明重组的EG2HSP70基因能在BL21中高效表达,表达的蛋白大部分以可溶性状态存在。亲和层析法纯化重组蛋白EG2HSP70,通过Western blot证实该重组蛋白能被细粒棘球蚴囊壁免疫兔血清识别。结论成功构建细粒棘球蚴中国大陆株pGEX-6P-1/EG2HSP70重组质粒,重组的EG2HSP70能够高效表达,表达的EG2HSP70具有免疫学活性。

秦川牛宰后成熟期间热休克蛋白A6对肉品质变化的影响机制

为探究秦川牛宰后热休克蛋白A6(heat shock protein A6,HSPA6)差异表达对肉品质的影响,以4℃条件下贮藏的秦川牛背最长肌为研究对象,测定贮藏0、2、4、6、8 d时肉品质变化情况;基于4D-非标记定量(4D-label free quantification,4D-LFQ)蛋白质组学分析宰后秦川牛背最长肌中HSP70家族成员HSPA6及相关差异蛋白表达情况。结果表明:随贮藏时间延长,HSPA6表达量呈下降趋势,三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、单磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide,NADH)含量均呈下降趋势,肌纤维小片化指数(myofibril fragmentation index,MFI)呈上升趋势,剪切力、离心损失率均呈先上升后下降趋势;由相关性分析结果可知,HSPA6表达量与ATP含量、NADH含量、剪切力呈显著正相关(P<0.05),与MFI、离心损失率呈极显著负相关(P<0.01),表明在贮藏过程中HSPA6降解与牛肉能量代谢及保水性有密切联系。蛋白质组学分析发现贮藏过程中表达量变化显著的差异蛋白中有24种与HSPA6表达相关,通过碳水化合物衍生物结合、嘌呤核苷三磷酸结合等途径引起蛋白酶体介导泛素依赖性蛋白质分解代谢、细胞蛋白分解等,造成代谢紊乱或者代谢失衡,同时还能够控制蛋白质降解、细胞凋亡等变化,进而影响肌肉结构变化,降低组织能量水平,并通过抗细胞结构蛋白降解最终影响秦川牛肉的嫩度、MFI及保水性。

铜锈环棱螺HSP70对Cd和BDE-47胁迫的响应敏感性

采用沉积物生物毒性测试,分别研究了不同含量Cd和BDE-47污染沉积物对铜锈环棱螺（Bellamya aeruginosa）肝胰脏热休克蛋白HSP70表达水平的变化,以揭示Cd和BDE-47胁迫与HSP70表达响应的时间/剂量-效应关系,探讨HSP70作为持久性有毒物质对铜锈环棱螺早期伤害生物标志物的敏感性。结果表明,受到不同含量Cd和BDE-47加标沉积物胁迫后,铜锈环棱螺肝胰脏HSP70表达均表现出较为明显的时间/剂量-效应关系。在Cd短期（0~10 d）暴露下,HSP70应激水平随Cd含量的升高而显著升高（p〈0.05）;在Cd长期（10~21 d）暴露下,HSP70应激水平随Cd含量的升高表现为先升后降,低Cd含量（5μg·g^-1）暴露下HSP70应激水平随暴露时间的延长而显著上升（p〈0.05）;中、高Cd含量（25、100μg·g^-1）暴露下HSP70应激水平随时间的延长均呈先升后降的趋势。不同含量BDE-47暴露下HSP70应激水平时间的延长大体上均呈先升高后降低的变化趋势;低、中含量BDE-47（160、640 ng·g^-1）短期暴露对HSP70应激水平没有影响,而长期（10~21 d）暴露后,HSP70应激水平均显著降低（p〈0.05）。比较而言,HSP70对Cd低含量（5μg·g^-1）短期（低于10 d）暴露显示出较好的敏感性,而对BDE-47低含量（160 ng·g^-1）短期暴露表现不敏感;低含量Cd和BDE-47长时间（10~21 d）暴露下,HSP70均具有较好的指示作用。

抗应激中药冲剂对猪肝脏热应激蛋白70表达的影响

研究抗应激中药冲剂对高温应激下猪肝脏组织热应激蛋白70(Hsp70)表达的调控效果。选取64头3月龄中国实验用小型猪,随机分为常温对照组、高温应激组、方Ⅰ、Ⅱ组,于高温第1,3,6,10天动态取样后,分别采用免疫组织化学和ELISA法测定肝中Hsp70的蛋白表达定位定量变化。结果表明,高温应激后,猪肝脏组织细胞阳性率显著增加(P<0.05),方Ⅰ、方Ⅱ组肝脏细胞阳性率显著高于常温组(P<0.05)但低于高温组(P<0.05);ELISA方法结果显示高温组、方Ⅰ、方Ⅱ组肝脏组织Hsp70含量显著增加(P<0.05),方Ⅱ组Hsp70含量在第3,6天比高温组显著增加(P<0.05)。因此,中药抗应激冲剂可通过增加肝脏Hsp70蛋白含量水平来提高机体细胞热耐受,达到保护作用,且方Ⅱ组效果优于方Ⅰ组。