禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为了对致病性强、危害性大的H5、H7、H9亚型禽流感病毒进行同时集成化快速检测,通过对GenBank已报道的禽流感病毒的HA基因进行序列分析比较,设计了H5、H7、H9 3个亚型的特异性引物和分别用3个荧光基团标记的Taqman MGB核酸探针。将各个亚型引物与探针优化组合,筛选出能够同时检测禽流感病毒H5、H7、H9 3个亚型、且对Ct值和扩增效率影响不大的3组引物和探针,建立了三重实时荧光RT-PCR方法。该方法特异性好,在我们检测的样品中,没有发现假阳性和假阴性现象。同时敏感性高,检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型的敏感性分别达到1 0001、000、500个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对禽流感H5、H7、H9 3个亚型的不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测3个病毒亚型。所建立的方法对保存的89个禽流感病毒样品进行检测,结果与经典检测方法(病毒分离鉴定、HA、HI)的符合率达100%。用上述建立的方法与鸡胚分离法同时对新鲜采集的4 000多份临床样品进行检测,两种方法的检测结果符合率为100%。

H5、H7和H9亚型禽流感病毒四重荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

旨在提高对禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)检测效率,及时发现疫病。本研究通过分析M基因以及H5、H7和H9亚型的HA基因序列保守区域,设计并合成了相关探针和引物,建立了禽流感病毒(AIV)四重荧光RT-PCR检测方法,该方法可在检测禽流感病毒(AIV)的同时,确定病原是否为H5、H7和H9亚型。结果显示,该检测方法耗时短、特异性好、检测下限达到10^-5 ng·μL^-1。采用该方法检测临床采集的13个活禽交易市场的384份禽咽喉和泄殖腔双拭子样品,经检测,其中有60份样品为流感病毒阳性,且全部是H9亚型,该结果与行业标准方法(NY/T 772-2013)检测结果一致,κ值为1(P<0.001)。本方法能实现对禽流感病毒及H5、H7和H9亚型的高通量快速检测,将在AIV快速检测中发挥重要作用。

H5、H7和H9亚型禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为快速、敏感、特异地鉴别诊断现较为重要的禽流感病毒亚型,根据H5、H7和H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成3对特异性引物,利用这3对引物对H5、H7和H9亚型禽流感病毒的HA基因片断进行多联RT-PCR扩增,并对多联RT-PCR检测方法进行敏感性及特异性实验。结果表明:3对引物能特异性地扩增出H5、H7和H9亚型禽流感病毒HA基因片段,大小分别为490bp,365bp和686bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立起快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。

多重反转录聚合酶链式反应检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒的研究

利用多重反转录聚合酶链式反应同时检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒.在GenBank中搜索H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的血凝素基因序列,并利用DNAStar软件分析其相似性,利用Primer Premier 5.0软件设计3对分别针对AIV H5、H7和H9亚型的特异性引物.这3对引物所扩增的cDNA片段大小分别为427、228和830 bp.结果表明,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术.该多重RT-PCR对H5、H7和H9亚型AIV能同时扩增出3条大小分别为427、228和830 bp的cDNA片段,与其他常见禽病病原的核酸不存在交叉反应.该多重RT-PCR对H5、H7和H9亚型AIV cDNA的最低检出量分别为10 pg、1 ng和10 pg.

肉鸡与蛋鸡H5、H7、H9亚型禽流感病毒抗体水平调查

为了解养殖场家禽中H5、H7、H9亚型禽流感病毒抗体水平,通过血清学调查,应用血凝抑制试验(HI)的方法,对四川内江、山东济南、河南鹤壁、江苏扬州4个定点实验观测站负责的养殖场的鸡血液样本进行禽流感病毒抗体分析,其中包含2个肉鸡场和3个蛋鸡场。研究发现蛋鸡场通常免疫了H5、H7、H9(或H5与H9)亚型禽流感疫苗,而肉鸡场只免疫了H9亚型禽流感疫苗;蛋鸡场和肉鸡场都存在免疫禽流感疫苗后抗体水平低和无抗体产生的情况,从而导致免疫不合格或免疫失败。以上结果表明,应加强家禽养殖场对不同亚型禽流感疫苗的免疫以及免疫后的禽流感病毒抗体水平监测,以防免疫失败,从而预防禽流感的发生和流行。

禽流感病毒H5、H7和H9亚型一步法多重RT-PCR检测方法的建立

为了建立能同时检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的方法,参考GenBank中H5、H7和H9亚型AIV的HA基因序列的保守区域,利用Primer 5.0软件设计3对分别针对AIV H5、H7和H9亚型的特异性引物,预期特异扩增H5AIV片段大小为380bp、H7AIV为501bp、H9AIV为732bp。经过反应条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的一步法多重RT-PCR方法。该方法特异性强,对其他亚型AIV和禽呼吸道病原体检测结果为阴性;敏感性高,H5、H7和H9亚型AIV RNA的最低检出量分别为10-4、10-4、10-2拷贝/μL。初步建立了快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒的分子生物学诊断方法。

禽流感H5、H7和H9亚型多重PCR方法的建立

为了建立能够同时检测禽流感H5、H7和H9亚型的多重PCR检测方法,本文分别针对各病毒亚型的HA基因高度保守序列设计了3对特异性引物。通过对反应条件的优化,成功建立了在一个反应中同时检测禽流感H5、H7和H9亚型的多重PCR诊断方法。根据其敏感性的结果可知,该方法对这3种亚型病毒的最低核酸检测量均为1×10^4拷贝/μL,且该方法特异性良好,具有灵敏、快速、成本低等优点,对禽流感病毒的流行病学调查具有指导意义。

广州地区2006-2012年人感染H5／H7／H9亚型禽流感病毒风险监测

目的分析2006—2012年广州市人禽流感监测结果，综合评估人群感染H5、H7、H9（H5／H7／H9）亚型人禽流感病毒的风险。方法广州市人禽流感监测系统包括职业暴露人群血清流行病学监测、环境标本病原学监测、禽流感疫情应急监测、流感样病例病原学监测、不明原因肺炎监测和重症肺炎排查5个部分。采用RT-PCR检测环境和呼吸道标本中H5／H7／H9禽流感病毒核酸，血凝抑制试验检测职业人群血清H5／H7／H9抗体。结果2006--2012年共采集禽鸟职业暴露人群和一般人群血清标本4103份，H5／H7／H9抗体总阳性率为3．82％。其中H5抗体阳性为0．22％，H9抗体阳性率为3．70％，H7抗体阳性率为0。有4份血清标本同时检出H5和H9抗体阳性。职业暴露人群H9阳性率（4．21％）高于对照人群（2．16％）。共采集外环境标本2028份，其中H5核酸阳性标本55份，阳性率为2．71％；H9核酸阳性标本14份，阳性率为0．69％。有5份标本同时检出H5和H9禽流感病毒核酸阳性，其中菜市场禽类摊点H5禽流感病毒核酸阳性率最高（3．03％，46／1518），未检出H7禽流感病毒核酸。历年应急监测所排查的高危人群和医学观察密切接触者、流感样病例病原学监测、不明原因肺炎和重症肺炎排查对象均未检出H5／H7／H9禽流感病毒核酸。结论广州地区涉禽环境中存在H5／H9禽流感病毒污染，以菜市场禽类摊点污染为主，禽类职业暴露人群存在一定的H5／H9禽流感病毒无症状感染者，提示广州地区禽类职业人群存在感染禽流感病毒的风险。

H5、H7和H9亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链式反应检测方法的建立

参考GenBank登录的H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的血凝素基因序列,利用DNAStar软件分析其同源性,利用Primer Premier5.0软件设计3对分别针对AIVH5、H7和H9亚型的特异性引物。3对引物所扩增的cDNA片段大小分别为427、228、830bp。结果显示,利用3对引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术。该方法对H5、H7和H9亚型AIV能同时扩增出3条大小分别为427、228、830bp的cDNA片段,与其他常见禽病病原不存在交叉反应。该方法对H5、H7和H9亚型AIVcDNA的最低检出量分别为10-4、10-2和10-4。结果表明,本试验建立了可同时检测鉴别H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术。

2017年潍坊市对首例H7N9禽流感疫情应急监测结果分析

目的 2017年4月潍坊市确诊首例人感染高致病性禽流感H7N9病例后,通过对密切接触者带毒情况调查及大范围活禽市场禽流感病毒开展监测工作,为疫情防控提供可靠实验依据。方法实时荧光定量PCR(RT-PCR)法对密切接触者咽拭子标本及活禽市场环境标本进行禽流感病毒的核酸检测。结果 103例密切接触者中,3例为H3亚型季节性流感病毒携带者,未发现H7N9病毒携带者。508份环境标本中,A型核酸阳性率为24.4%,其中H7亚型阳性率为10.2%,明显高于H5亚型(0.2%)、H9亚型(5.5%)及H7和H9亚型双阳性(3.0%);各类型标本中,宰杀或摆放禽类案板表面擦拭标本(14.0%)和清洗禽类污水等标本中,H7亚型检出率高于与其他类型标本中的阳性率,差异有统计学意义(χ2=8.67,P<0.05)。结论潍坊市活禽市场H7亚型禽流感病毒污染情况较普遍,提示人感染H7N9风险较高,因此需采取强有力措施以控制疫情进一步扩散。

北京市密云县鸭养殖人群禽流感病毒感染情况调查

目的了解北京市密云县鸭养殖人群中H5、H7、H9病毒感染水平。方法采取随机抽样方法抽取6个乡镇作为监测点,调查对象分为个体规模化养鸭者、家庭养鸭者,按照标准选择调查对象,进行问卷调查和血清禽流感抗体检测。结果共调查221人,其中个体规模化养鸭者22人、家庭养鸭者199人,两类人群H5、H7抗体均为阴性,H9抗体阳性率规模化养鸭者组未检出,家庭养鸭者组为2.01%。结论目前密云县地区人群中尚无H5、H7亚型病毒感染情况,H9亚型禽流感病毒在家庭养鸭者人群中有不同程度的感染,应加强对家庭养鸭人群的监测和干预。

2013-2017年河南省涉禽环境中禽流感病毒污染状况监测

目的监测河南省范围内涉禽环境中禽流感病毒污染状况。方法2013-2017年每月从全省7个监测点采集涉禽环境标本，采用荧光RT-PCR法检测禽流感病毒A型（FluA）核酸，FluA核酸阳性标本进一步检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒核酸。结果2013-2017年从全省7个监测点共采集外环境标本2538份，禽流感病毒FluA核酸阳性标本202份，阳性率为7．96％：H5核酸阳性标本16份，阳性率为0．63％；H7核酸阳性标本8份，阳性率为0．32％；H9阳性标本161份，阳性率为6．34％。连续5年，FluA的检出率除在2015年有小幅波动外，整体趋势是大幅上升的，其中H7亚型禽流感病毒仅在2015年和2017年有检出。2月份是一年当中禽流感病毒检出率最高的月份，其次是1月份。不同环境类型中，城乡活禽市场FluA的检出率最高，为13．69％，其次是家禽屠宰加工厂（2．58％）和家禽规模养殖户（0．58％）。不同标本类型中，脱毛机拭子、案板表面拭子、粪便标本和禽类饮用水的FluA检出率依次为28．57％、13．76％、5．70％和5．26％。结论河南省涉禽环境中存在H5／H7／H9亚型禽流感病毒的污染。且污染状况越来越复杂。逐渐复杂的活禽进货销售渠道是禽流感病毒污染严重化的主要原因。封锁疫情发生地区的禽，避免其销往外地将是禽流感防控的有效措施。

2009-2014年济南市人群禽流感病毒感染风险分析

目的综合分析济南市2009-2014年流感、禽流感和不明原因肺炎监测结果,以评估人群感染禽流感的风险。方法通过涉禽环境标本监测、职业暴露人群血清学监测、流感哨点医院监测、不明原因肺炎监测等建立禽流感监测体系。结果 2009-2014年共采集外环境标本1 151份,A型通用病毒核酸阳性率为3.04%(35/1151),其中H5阳性率为2.00%(23/1151),H9阳性率为1.04%(12/1151),未检出H7阳性标本。城乡活禽市场禽流感病毒核酸检测阳性32份,阳性率为7.10%(32/451),家禽规模化养殖场禽流感病毒核酸检测阳性3份,阳性率为0.43%(3/700),城乡活禽市场阳性率高于家禽规模化养殖场(χ2=41.347,P<0.05)。不同种类环境标本中清洗禽类污水禽流感病毒核酸阳性率(8.05%)最高。采集职业暴露人群血清873份,H5N1抗体阳性率为0.34%(3/873)。4家流感哨点医院采集流感样病例鼻咽拭子标本8 291份,流感病毒分离阳性率5.61%(465/8 291),未分离到H5/H7/H9亚型毒株。2009-2014年济南市共报告不明原因肺炎12例,其中1例确诊为H5N1亚型禽流感。结论济南市涉禽环境中存在H5/H9禽流感病毒污染,职业暴露人群存在H5N1禽流感隐性感染者,不排除发生禽流感散发病例的可能,但人群发生禽流感病毒感染的风险较低。

2015—2021年云南省禽流感环境监测分析

目的了解2015—2021年云南省涉禽环境中禽流感病毒的污染状况。方法从云南省16个地区选择5类涉禽场所,并采集6种环境样本(笼具表面擦拭样本、案板表面擦拭样本、禽类粪便样本、清洗禽类的污水样本和禽类饮水样本),采用Real-time PCR法开展禽流感病毒A型核酸检测,核酸阳性样本进一步开展H5、H7和H9亚型检测。结果2015—2021年云南省共检测环境样本11033份,禽流感病毒A型核酸阳性样本2951份,阳性率为26.75%,以H9亚型为主(2164份)。城乡活禽市场和活禽批发市场的样本阳性率均较高,分别为36.08%和35.06%。6种环境样本中清洗禽类污水阳性率最高(45.50%),其次为案板表面样本(35.06%)。保山、文山和怒江为云南省禽流感病毒核酸阳性率前3位的地区。结论云南省涉禽环境中禽流感病毒污染较为严重。

河南省2013年禽流感病毒外环境分布及职业暴露人群感染情况调查

目的了解河南省外环境中禽流感病毒H5、H7、H9亚型分布及职业暴露人群禽流感病毒(H5、H7)的感染状况。方法 2013年从全省7个监测点采集从事家禽养殖、屠宰等人群的血清标本,用红细胞凝集抑制试验(HI)检测H5N1和H7N9抗体,抑制效价≥1∶160判定为抗体阳性;同时采集外环境标本,采用RT-PCR法检测禽流感病毒(Flu A)、H5、H7和H9核酸。结果共采集职业暴露人群血清493份,H5N1和H7N9抗体检测均为阴性。环境标本486份,Flu A核酸阳性标本3份,阳性率为0.62%;其中2份H5亚型核酸阳性,为3月采集于屠宰厂的粪便标本;1份H9亚型核酸阳性,为11月采集于城乡活禽市场的清洗禽类的污水。结论河南省外环境中存在H5、H9亚型禽流感病毒的污染,暂未检测到职业暴露人群隐性感染。