禽流感病毒H5HA、H7HA基因共表达核酸疫苗质粒的构建及其在体外的表达

为了获得既能对 H5亚型又能对 H7亚型 AIV攻击产生保护的核酸疫苗 ,设计构建了含有双顺反子的真核表达载体 ,用限制性内切酶从 PCIH7HA载体上切得 AIV H7HA基因的c DNA,此 c DNA含有 CMV启动子和 Poly(A)终止序列 ,使用 DNA 连接酶引入载体PCIH5HA中 ,最后获得双顺反子真核表达载体PCI-H5HA-H7HA,其中 H5HA和 H7HA基因都带有自己的 CMV启动子和 Poly(A)终止序列。选用 2 93 -T真核表达细胞系 ,用脂质体转染法导入细胞进行瞬时表达 ,转染后 48h用荧光标记的兔抗鸡 Ig G进行间接免疫荧光试验。结果表明双顺反子真核表达载体构建正确 ,且在真核表达细胞系中 H5HA和 H7HA基因都能获得表达 ,且 H5HA 基因的表达效果优于H7HA。

禽流感病毒H5HA基因在马铃薯中的表达

将编码禽流感病毒H5N1亚型HA基因(H5HA)的cDNA片段与CaMV35S启动子融合,通过农杆菌介导法转化马铃薯.分别用PCR,RT-PCR和Western斑点杂交方法对重组H5HA基因在马铃薯植株中的表达情况进行分析.实验结果表明,获得的12株转基因植株中,11株为阳性.Western斑点杂交检测表明H5HA重组蛋白已在马铃薯体内表达.这一结果将为利用马铃薯作为生物反应器生产禽流感口服疫苗提供理论依据.

不同启动子对禽流感病毒H5HA基因在马铃薯体中表达的影响

将编码禽流感病毒H5N1亚型的血凝素基因H5HA的cDNA片段分别与马铃薯GBSS I和甘薯SpoA基因启动子序列融合,通过农杆菌介导法将重组基因转入马铃薯,分别用PCR、Western(印迹杂交和斑点杂交)方法对重组基因在马铃薯中的表达情况进行了分析.并将其结果与融合CaMV35S启动子的H5HA重组基因在马铃薯体内的表达情况进行比较.分析结果表明,3个重组的H5HA基因在马铃薯薯块中均获得了表达,其表达量最高的是融合GBSS I启动子的H5HA重组基因,最低的是融合SpoA启动子的H5HA重组基因.

基于Spyligase技术的禽流感血凝素H5HA10多聚体抗原的高效制备

利用Spyligase技术在H5HA10序列的C端和N端分别加上SpyTag和KTag序列,并分别与His6-ArsC、His6-PAS200、His6-XTEN、His6-PEAT、SiTag3-SUMO、SiTag3-MBP、SiTag3-PAS200、SiTag3-XTEN和SiTag3-ArsC促溶标签相连,成功构建了含9种不同促溶性标签的H5HA10重组表达载体,同时构建了1种含有Cherry标签的Spyligase重组表达载体。将这10种重组载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达和SDS-PAGE分析,筛选出可以显著促进H5HA10重组蛋白表达的融合标签ArsC。通过优化诱导表达条件,在大量诱导表达、纯化后成功获得了高纯度的H5HA10和Spyligase重组蛋白,最终在PCT缓冲体系中, Spyligase促使H5HA10重组蛋白的蛋白聚合,形成了环化单体、三聚体、六聚体以及九聚体。

重组腺病毒rAd-H5HA-EGFP对小鼠免疫保护性的研究

将重组腺病毒rAd-H5HA-EGFP以不同免疫剂量接种BALB/c小鼠,通过检测小鼠免疫后的抗体以及抵抗H5N1亚型流感病毒攻击的保护对rAd-H5HA-EGFP的免疫保护性进行了评估。分别以108 TCID50、107 TCID50的rAd5-H5HA-EGFP免疫小鼠,初次免疫后3周进行加强,剂量为2×108 TCID50和2×107 TCID50,同时以接种rAd5-EGFP和PBS的小鼠作为对照。二免后3周,将各组试验小鼠随机分为2组,分别应用106 EID50的SW/FJ/1/01株和CK/HuN/77/05两株H5N1亚型流感病毒进行攻击。结果显示,重组病毒108 TCID50和107 TCID50的免疫剂量均能够诱导高水平的HI抗体生成,rAd-H5HA-EGFP免疫小鼠在受到病毒SW/FJ/1/01和CK/HuN/77/05攻击后,与接种腺病毒rAd-EGFP和PBS的对照组小鼠相比,没有出现明显的体质量减轻,攻毒后病毒在免疫小鼠体内的复制被完全或部分抑制,脏器内检测到的病毒含量明显低于对照组小鼠;免疫小鼠在受到CK/HuN/77/05毒株攻击时,没有出现死亡(0/5),而接种rAd-EGFP和PBS的对照组小鼠均有死亡,死亡比例分别为4/5和5/5。以上结果表明,该重组rAd-H5HA-EGFP对小鼠具有良好的免疫保护性,有望成为1株新型H5N1亚型动物流感疫苗的候选重组毒株。

一种共表达不同亚型禽流感病毒基因且形成病毒样颗粒的真核表达载体的构建与鉴定

动物流感DNA疫苗是非常有应用前景的新型疫苗之一,本研究构建了能同时表达禽流感病毒2种血凝素H5HA和H9HA以及1种神经氨酸酶N1NA的真核表达质粒。间接免疫荧光结果表明,构建的真核表达质粒转染MDCK细胞后,同时表达出H5HA、H9HA和N1NA蛋白;转染293T细胞上清通过血凝试验可检测到2-4血凝价;通过透射电镜观察到了病毒样颗粒。本研究用一种质粒同时表达不同亚型流感病毒蛋白并且形成了病毒样颗粒,为流感病毒多价DNA疫苗研究提供了坚实基础。

一种新的基于3D图形的进化树构造方法

生物信息资源更新越来越快,使用可视化的方法来分析DNA序列已成为生物信息学的一个研究热点,用图形表示DNA序列的方法越来越成熟。基于DNA序列的3D图形表示法,提出一种新的进化树构造方法:将DNA基本序列表示成空间3D图形,并计算与序列相对应的非负实对称矩阵;计算新的特征参数C表征序列特性,并获得相对进化距离;基于可凝聚的层次聚类算法构造不同基因序列的进化树。采用中国不同地区的12组禽流感基因HA(H5N1)序列进行试验,最后获得了相应的进化关系。

表达禽流感H5N1血凝素抗原(HA)和H9N2血凝素抗原(HA)融合基因重组腺病毒二价苗的构建

为了构建禽流感病毒H5N1亚型禽流感病毒HA和H9N2亚型禽流感HA融合基因表达的重组腺病毒。根据流行病学调查并参考文献研究结果,合成了优势流行H5N1和H9N2的保护性抗原HA基因的融合基因片段,并将该融合基因片段克隆到在pUC57载体,命名为pUC-57H5H9HA。该融合基因片段经特异酶切后与腺病毒穿梭质粒pDC315连接,获得携带目的融合基因腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA;将该重组穿梭质粒与AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒(pBHGlox(delta)E1,3Cre)经Cre/loxP酶切重组,构建成重组腺病毒(rAd-H5H9HA);Ad-H5H9HA感染293细胞后,扩增病毒基因,纯化病毒及检测病毒滴度。PCR鉴定及基因测序分析,H5N1HAH9N2HA(H5H9HA)融合基因表达的重组腺病毒载体构建成功;经过重组腺病毒r Ad-H5H9HA免疫SPF鸡后的抗体检测,证实了重组腺病毒r Ad-H5H9HA诱导了H5N1和H9N2的特异抗体,而且抗体水平达到了国家免疫标准。本研究成功构建的重组腺病毒rAd-H5H9HA,可以作为预防H5N1和H9N2两个亚型病毒的二价疫苗使用,为将来禽流感的预防控制提供了一种新的可能。

H5N1亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的表达鉴定及免疫原性研究

目的为了获得H5N1HA蛋白,利用昆虫杆状病毒表达系统表达了A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(clade2.3.2.1)的HA基因并获得重组H5N1亚型流感病毒HA蛋白。方法将H5N1亚型2.3.2.1谱系的HA蛋白基因扩增并克隆到pFastBacⅠ载体中,构建重组穿梭质粒,转染昆虫sf9细胞后获得重组杆状病毒,对大量培养后表达的H5N1HA蛋白进行SDS-PAGE、Western blot和间接免疫荧光检测。分别在0d和14d用纯化的表达产物HA蛋白免疫小鼠,免疫两周后进行H5N1攻毒试验,记录小鼠体重变化率及生存率。结果测序鉴定重组表达载体构建正确;SDS-PAGE显示纯化的表达蛋白分子质量为65ku;Western blot分析该蛋白能够被兔抗流感病毒IgG识别;鸡抗流感病毒抗体间接免疫荧光法测定HA蛋白的表达,在感染HA的昆虫细胞中出现特异性荧光;攻毒试验表明HA蛋白能够在小鼠体内诱导产生免疫应答并且保护H5N1流感病毒的致死性攻击。结论成功的表达了H5N1的HA蛋白,并且此HA蛋白能成功的诱导小鼠体内的免疫反应,并起到良好的保护作用。