2株H5N6亚型禽流感病毒的遗传进化分析

为了解禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的遗传进化特点,试验对2022—2023年从我国湖南和福建活禽交易市场分离的2株鸭源H5N6亚型AIV进行全基因组测序、关键氨基酸位点分析和遗传进化树构建,这2株AIV分别为A/duck/Hunan/QG3/2022(H5N6)(简称HN/QG3)和A/duck/Fujian/QG4/2023(H5N6)(简称FJ/QG4)。结果显示:HN/QG3株属于2.3.4.4b分支,其基因组来源于H5N6和H5N8毒株,与鸭、野鸟、环境和人类来源的H5亚型AIV的同源性较高,而FJ/QG4株属于2.3.4.4h分支,HA基因与分离株A/Rattus norvegicus/China/FS21/2021(H5N6)的相似性为97%,而其他基因片段与2021年广东地区分离的人源H5N6亚型AIV的同源性较高;2株H5N6亚型AIV的HA蛋白裂解位点含有多个连续的碱性氨基酸,符合高致病性AIV的分子特征,HA蛋白第226和228位分别为Q和G,说明H5N6亚型AIV具有优先结合禽源α2,3-唾液酸受体的特征,并且NA蛋白第58~68位缺失11个氨基酸,对小鼠的致病性可能增强。研究表明,2株鸭源H5N6亚型AIV分别属于2.3.4.4b分支和2.3.4.4h分支,其对人源α2,6-唾液酸受体的识别能力增强,毒力和传播能力可能增强。

云南省首例人感染H5N6禽流感病例调查与分析

目的分析省内首例既全球第3例人感染H5N6禽流感病例的流行病学调查结果,总结人感染H5N6禽流感病例的流行病学特征,为今后人感染H5N6禽流感病例的排查及流行病学调查提供参考。方法回顾性描述、分析云南省首例人感染H5N6病例流行病学调查过程、疫点及密切接触人员采样检测结果,总结人感染H5N6禽流感病例的流行病学特征。结果我省首例人感染H5N6禽流感确诊病例为单个病例,未出现人传人,发病前有野禽接触史及菜市场活动史,住地菜市场部分禽类摊档标本H5N6禽流感病毒核酸检测阳性。结论我省首例人感染H5N6禽流感病例为本地感染非人传人病例,传播途径可能为禽-环境-人或禽-人。

安徽省首例人感染H5N6禽流感病例的调查与分析

目的分析安徽省首例人感染H5N6禽流感病例发病与流行病学特征,为制定监测方案与防控措施提供科学依据。方法对人感染H5N6禽流感病例、密切接触者、感染来源进行流行病学调查,采集相关生物和环境标本进行实验室检测,应用描述性流行病学方法进行分析。结果安徽省首例人感染H5N6禽流感病例为单个散发病例,密切接触者无感染,早期临床表现无特异性,发病前一周有明确的病死禽接触史,病禽市场检出2份H5N6阳性标本。结论该病例为本地感染病例,感染来源与接触病死禽有关,未发现人传人的证据。

人感染高致病性H5N6禽流感病毒的分子生物学特征

目的分析2014-2015年3例新型人感染高致病性禽流感（HPAI）H5N6毒株的血凝素（HA）与神经氨酸酶（NA）基因序列,探讨该病毒的遗传变异及分子生物学特征。方法收集Gen Bank、全球共享禽流感数据倡议组织（GISAID）及浙江大学传染病诊治国家重点实验室提供的H5N6病毒基因序列,利用生物信息软件MEGA6.0及Net Nglyc服务器对基因序列进行遗传进化和分子变异特征分析。结果 3例感染HPAI-H5N6患者毒株的HA与NA氨基酸序列的同源性分别为96.5%～98.7%和90.1%～98.2%;HA氨基酸序列比对分析发现A/Guangzhou/39715/2014（H5N6）和A/Sichuan/26221/2014（H5N6）与A/duck/Eastern China/1111/2011（H5N2）同源性最近,分别为97.7%和98.5%;A/Yunnan/0127/2015（H5N6）与A/muscovy duck/Vietnam/LBM631/2014（H5N1）同源性最近（97.2%）;NA氨基酸序列比对分析发现A/Guangzhou/39715/2014（H5N6）和A/Yunnan/0127/2015（H5N6）与A/swine/Guangdong/K6/2010（H6N6）同源性最近,分别为97.2%和97.6%,A/Sichuan/26221/2014（H5N6）与A/duck/Guangdong/S3073/2010（H6N6）同源性最近（97.4%）;进化树分析显示3例患者毒株处于2个不同的分支;HA基因包含有S137A、T160A等突变,糖基化分析显示有6～7个N-糖基化位点。结论新型人感染HPAI-H5N6病毒是一种重组病毒,其HA基因来源于亚洲禽类H5亚型,NA基因来源于亚洲禽类H6N6;HA基因位点突变及N-糖基化改变可能有助于增强对人类的感染。

H5N6亚型禽流感病毒反向遗传疫苗株的构建及免疫保护试验

为应对抗原性已发生变异的第2.3.4.6分支H5N6亚型禽流感病毒(AIV)引发的潜在流行,本研究利用反向遗传操作技术,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以H5N6亚型AIV A/Chicken/SC/6/2014(C6)的基因组为模板,经RT-PCR扩增其HA及NA基因,并对HA基因进行分子修饰,去除与H5亚型AIV致病力有关的HA蛋白裂解位点处的多个碱性氨基酸,使其获得低致病性AIV的分子特征(即将-PLRERRRKR-突变为-PQRETR-),成功构建了H5N6亚型AIV疫苗候选株r C6。免疫效力试验表明,r C6重组灭活疫苗可以诱导产生高水平的血凝抑制抗体。免疫攻毒保护试验表明,r C6重组灭活疫苗可以提供SPF鸡抵抗同源和异源H5N6病毒100%的保护,而针对第2.3.4分支的Re-5疫苗仅能提供大约10%的保护。利用反向遗传技术构建的r C6重组疫苗候选株为该分支病毒的防控提供了有益的尝试。

湖北省首例人感染H5N6禽流感病例实验室检测结果分析

目的分析湖北省首例人感染H5N6禽流感病例的实验室检测结果,为更好地检测人禽流感疑似病例标本提供参考。方法对患者的不同病程、不同种类的标本进行实验室检测并进行分析。结果我省首例人感染H5N6禽流感确诊病例只有前期的痰液标本检测到H5N6核酸,其它时间未检测到。结论疑似人感染H5N6禽流感病例标本采集一定多样化,而且一定采集到初期的痰液标本。

河南省首例人感染H5N6禽流感病例的流行病学及临床特征

目的:分析河南省首例人感染H5N6禽流感病例的流行病学及临床特征。方法:2022年3月24日,河南省首次报告一例人感染H5N6禽流感确诊病例。参照《人感染动物源性流感预防控制技术指南(试行)》,疾控机构专业人员对病例开展现场流行病学调查,对涉及的工作场所、病例居住地以及禽类来源地等开展环境标本病原检测。结果:患者临床表现主要为高热、咳嗽、呼吸困难,后因呼吸衰竭死亡;病例有明确的禽肉相关暴露史,早期肺泡灌洗液、禽肉及工作场所环境标本H5N6禽流感病毒核酸均为阳性。结论:该例人感染H5N6禽流感病例通过职业暴露感染,未发现人传人的证据。

我国长三角地区首例人感染H5N6禽流感病毒的分离、鉴定与进化特征

目的对我国长三角地区首例人感染H5N6禽流感进行病毒分离、鉴定和进化分析。方法通过荧光定量RTPCR法进行流感病毒分型检测,阳性标本用SPF鸡胚进行病毒分离,对病毒分离物进行全基因组扩增测序,利用Blastn、ClustalX和Mega 6.1等软件进行序列比对和系统进化分析。结果2019年11月禽流感患者标本中分离到1株H5N6禽流感病毒毒株,该病毒属于clade 2.3.4.4h,其HA蛋白裂解位点含有多个碱性氨基酸,为高致病性禽流感病毒。病毒HA蛋白的Q222和G224位氨基酸未发生突变,保留了禽类受体α2-3半乳糖苷唾液酸结合特性;AA158位点丧失糖基化,但AA124出现1个新的潜在糖基化位点。结论长三角地区首例人感染的H5N6禽流感病毒是1株新基因重配的高致病性禽流感病毒,与近年来家禽中流行的病毒高度同源,提示应该加强对禽流感病毒的监测和跨种传播的研究。

中国鸭源H5N6 AIV血凝素和神经氨酸酶基因特征及遗传进化分析

为明确中国鸭源H5N6 AIV的HA和NA基因特征及其遗传变异情况,研究选取了NCBI流感病毒资源库里的32株具有完整ORF编码区的中国鸭源H5N6 AIV的HA和NA基因序列,利用分子生物学软件分析其HA和NA基因特征及其遗传进化情况。结果显示,中国鸭源H5N6 AIV的HA裂解位点有REKRRKR↓G、RERRRKR↓G和KEKRRKR↓G三种类型,HA有6个潜在的N-糖基化位点,其中第182、222、224位氨基酸依次为N、Q、G,具有与禽源唾液酸α-2,3受体结合的特性,然而HA发生了S123P/T、T156A、S223R氨基酸位点突变,部分毒株发生了I151T氨基酸位点突变;HA基因核苷酸遗传进化分析显示,中国鸭源H5N6 AIV遗传进化上均处于clade2.3.4.4分支,并进一步进化出Ⅰ和Ⅱ两个亚分支。部分中国鸭源H5N6 AIV NA第59~69位缺失11个氨基酸,中国鸭源H5N6 AIV NA基因遗传进化上分为两个大的分支,分别对应NA基因颈部缺失型和完整型两种类型;NA颈部完整型的NA有6个潜在的N-糖基化位点,NA颈部缺失型的NA由于第59~69位氨基酸的缺失,导致其第67位丢失了一个N-糖基化位点。研究为中国鸭源H5N6 AIV的生物学特性和遗传进化特征研究奠定基础。

对1例救治成功的人感染H5N6禽流感重症病例的报道

本文主要是介绍1例人感染H5N6禽流感重症患者的诊疗过程。在进行临床常规治疗无效的情况下对该患者使用抗病毒药物、机械通气联合ECMO疗法进行治疗,然后观察治疗的效果。经上述治疗后,该患者痊愈出院。本研究的结果表明,用抗病毒药物、机械通气联合ECMO疗法对人感染H5N6禽流感重症患者进行治疗的效果较好。

人感染H5N6禽流感重症患者医院感染防控实践

目的:探讨人感染H5N6禽流感重症患者医院感染预防和控制措施的可行性及效果。方法:针对收治的1例人感染H5N6禽流感重症患者,按照相关预防与控制技术指引,通过侵入性操作管理、人员防护、患者管理、空气与环境表面消毒等环节实施医院感染的预防和控制措施。结果:所有密切接触的医务人员、其他住院患者及其家属均未出现异常,未发生院内交叉感染。结论:针对人感染H5N6禽流感患者、接触人员及治疗环境等严格执行消毒隔离制度,实施正确的医院感染预防和控制措施,可有效地防止院内感染,从而阻断疾病传播。

一起人感染H5N6流感病毒事件引发的禽间流行病学调查

2022年3月24日,河南省卫健委通报,台前县一名鸭屠宰分割人员感染H5N6亚型流感病毒。为调查可能的传染源、传播途径,降低禽间疫情发生风险和公共卫生风险,重点对该病例工作的台前县某食品公司及周边3 km范围内易感动物开展了禽流感紧急流行病学调查和抽样监测,并对全县禽养殖场户开展了禽流感流行病学调查和监测。在该食品公司的鸭头和环境样品中检出H5N6亚型流感病毒核酸阳性,但在养殖场及野鸟栖息地的所有样品中均未检出病原阳性。分析认为:该病例通过密切接触携带病毒的鸭体而感染的可能性较大;病例所感染病原很有可能是通过带毒野禽引入的,同时也不排除家禽跨区域调运引入的可能。当地家禽发生高致病性禽流感疫情的风险较低,但不能忽视对禽流感的防控。

福建省人感染H5N6禽流感病毒与外环境禽流感病毒相关性分析

目的分析福建省外环境H5亚型禽流感病毒分布情况及与人感染H5N6禽流感的关系,为人感染禽流感的科学防治提供依据。方法收集2013-2017年福建省外环境常规监测标本信息,进行统计分析。从数据库下载相关禽流感病毒基因序列,进行基因同源性比对和系统进化分析。结果外环境监测结果统计分析显示:2013-2017年共采集样本4 903份,H5亚型阳性率为4.24%,且不同的网络实验室(χ~2=101.033)、监测场所(χ~2=45.526)、标本类型(χ~2=31.751)和季节(χ~2=48.174)阳性率均存在统计学差异(P<0.05)。福建省首例人感染H5N6禽流感(A/Fujian-Sanyuan/21099/2017)病毒全基因序列与6株福建省外环境H5N6病毒的同源性在85.1%~98.5%,与病家院中采集的1株加强监测外环境标本的HA和NA基因同源性分别为100.0%和99.9%。系统进化分析显示:福建省人感染H5N6病毒HA基因与加强监测的外环境H5N6病毒的进化距离最近,与其余6株距离较远,处在不同的进化分枝中,其基因源于H5N8病毒;而NA基因则与7株外环境H5N6病毒的进化距离较近,源于H5N6病毒。结论福建省冬春季外环境中禽流感活动较为活跃,应加强活禽交易市场的卫生管理工作。福建省发现的首例人感染H5N6禽流感与外环境禽流感病毒的重配可能存在一定的相关性。

H5N6亚型流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为研制H5N6亚型流感病毒核酸快速检测试剂盒,选择H5N6亚型流感毒株序列相对最保守的HA基因和NA基因作为H5N6检测的靶序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针的双重荧光RT-PCR快速检测H5N6亚型禽流感病毒的方法。实验结果表明,所建立的H5N6亚型流感病毒real time RT-PCR检测方法 HA基因检测的灵敏度为10^(-5),NA基因检测的灵敏度为10^(-4),重复性良好,特异性佳。结论:本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H5N6亚型流感病毒。

一株H5N6亚型禽流感病毒对鸭和小鼠的致病性研究

为了研究一株从鹭中分离到的禽流感病毒(AIV)A/Heron/Guangdong/C1/2013(H5N6)对鸭和小鼠的致病力,本研究通过对鸭和小鼠滴鼻点眼和鸡的颈静脉注射进行攻毒试验,观察其致病力和组织病理学等变化,对其生物学特性进行初步研究。结果显示,该毒株的鸡胚半数感染量(EID50)为10-8.16/0.1 mL,静脉接种致病指数(IVPI)为2.76。对鸭的半数致死量(LD50)为10-4.0/0.2mL,对小鼠的LD50为10-4.67/0.05mL。以106 EID50/只滴鼻点眼感染鸭,主要表现为食欲下降、精神萎靡、肿头流泪等症状,大多数鸭在感染后4~7d死亡,感染后第7天肝脏、肺脏、肾脏仍在排毒,解剖可见心包积液、肺脏淤血、肾脏肿大等症状,病理切片可见心脏、肝脏、脾脏、肾脏炎性细胞浸润,脑细胞核固缩等病变。以5×105 EID50/只滴鼻感染小鼠,主要表现为食欲下降、精神萎靡、被毛粗乱、聚堆等症状,大部分小鼠在感染后5~7d死亡,第7天时只有肺脏仍在排毒,各脏器解剖学病变不明显,病理切片可见心脏、肾脏、肺脏炎性细胞浸润,脑细胞核固缩等病变。研究结果表明,该H5N6亚型AIV毒株对鸭和小鼠具有很强的致病力,IVPI大于1.2,为高致病性AIV,本研究为H5N6亚型AIV研究和防控提供了理论基础。

多重荧光定量RT-PCR检测高致病性H5N6禽流感病毒

目的建立一种快速检测流感病毒A型(FluA)及高致病性禽流感(HPAI)H5N6病毒感染的荧光定量RT-PCR法。方法以人细胞核糖核酸酶P(RP)基因作为临床样本的内参基因,用Primer Express 3.0软件设计PCR特异性引物和探针,建立一种检测FluA及HPAI-H5N6病毒的一步法多重荧光定量RT-PCR方法,评估其灵敏度、特异性,并与上海之江公司提供的试剂及测序法进行比较。结果建立的多重荧光定量RT-PCR法检测FluA、H5、N6及RP质粒标准品的灵敏度均达102copies/m L。各对引物和相应探针仅检测出相应的病毒,在这些病毒和常见病原分析中未发现存在交叉反应,特异性达100%。用该法检测135例临床标本,结果显示FluA为23例,未发现HPAI-H5N6病毒的感染者;与上海之江公司提供的试剂的检测结果及基因测序结果一致。结论建立的一步法多重荧光定量RT-PCR法可用于FluA及HPAI-H5N6病毒感染患者的早期诊断。

华东地区高致病性H5N6禽流感病毒血凝素蛋白分子特征分析

目的分析2017年以来中国华东地区高致病性H5N6禽流感病毒的HA基因分子特征。方法 H5N6核酸阳性标本采用9~11日龄鸡胚进行病毒分离,病毒基因测序采用下一代测序技术,相关的参考序列下载自GISAID或NCBI网站,序列比对和进化树构建采用ClustalX、Blasts及Mega 6.1等生物信息学软件。结果 2017年以来,在江苏省活禽市场和禽流感患者的标本中,成功分离出43株H5N6禽流感病毒,对33株病毒进行了基因组测序。选择其中的27株H5N6病毒的HA基因进行分子进化分析,clade 2.3.4.4h有20株,clade 2.3.4.4e有3株,另外4株归类于clade 2.3.4.4b;多个碱性氨基酸出现在病毒HA蛋白的裂解位点,是高致病性禽流感病毒的典型分子特征;HA蛋白受体结合位点的222和224位氨基酸分别是Q和G,具有结合禽类受体α2-3半乳糖苷唾液酸(SAα2-3Gal)的特性,158位点糖基化位点丢失,但新的糖基化位点出现在124位点上。结论 2017年HA基因clade 2.3.4.4h是我国华东地区H5N6病毒优势基因型,病毒处于持续动态进化中,需要继续对病毒进化进行监测。

山西省某灰雁养殖场H5N6高致病性禽流感暴发调查

2017年5月26日至6月5日,山西省某养殖专业合作社养殖的灰雁出现了发热、腹泻(拉黑绿稀便)、头颈后仰、失明等症状,并陆续死亡,共死亡625只,袭击率为52.08%(625/1 200),经国家禽流感参考实验室检测,确诊为H5N6亚型高致病性禽流感。采用问卷调查方式,对场内基本情况、免疫情况、调运情况及发病情况进行调查。调查发现,发病灰雁系5月26日调入,调运前未进行H5N6亚型禽流感免疫,因此调入时可能已感染禽流感病毒是此次暴发的主要原因。对全市范围的养殖禽类进行禽流感疫情排查,未发现其他疫情。调查结果提示:加强所有饲养禽类的禽流感免疫,建立有效的免疫屏障,对于控制禽流感疫情暴发具有重要意义;养殖场在购入禽类时,应认真查验检疫票证,了解免疫背景,并建立完善的养殖管理档案。

一株低致病性H5N6亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性分析

2019年11月本实验室从家禽监测样品中分离鉴定到一株低致病性H5N6亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/chicken/Hebei/S1/2019(H5N6)(简称CK/HeB/S1/19)。为进一步了解其生物学特点,本实验对其全基因组测序并进行遗传演化分析,结果显示,该病毒属于2.3.4.4h分支,碱性裂解位点为PLRESR↓GLF,属于低致病性AIV(LPAIV)。对其各基因节段分别经BLAST比对后发现,其外部基因来源于H5N6亚型AIV,内部基因完全来源于H9N2亚型AIV,推测该分离株为一株重组病毒。将CK/HeB/S1/19病毒株接种SPF鸡及BALB/c小鼠研究其致病性,结果显示,该病毒虽然能够感染鸡,但不能在鸡体内有效复制,而该病毒未经适应就可在3只小鼠的鼻甲和肺中进行复制,对小鼠呈低致病性。本研究为H5亚型AIV的检测和其感染的综合防控提供了参考依据。

辽宁省一起野禽H5N6高致病性禽流感疫情的紧急流行病学调查

2021年4月6日,辽宁省沈阳市和平区长白岛森林公园内饲养的10只黑天鹅和1只大雁死亡,袭击率为3.8%(11/291)。经现场调查和临床剖检诊断,市级和省级疫病控制中心实验室检测,诊断为疑似H5亚型高致病性禽流感。随后,经国家禽流感参考实验室确诊为H5N6亚型高致病性禽流感。4月12日,农业农村部公布了该起疫情。在接到疫情报告后,辽宁省农业农村厅立即组织紧急流行病学调查组,采用现地察看、座谈、问卷调查、实验室检测等方式,对疫情发生情况进行调查,追溯疫情来源,追踪疫情扩散风险,并提出针对性防控措施。经综合判定,疫情由迁徙候鸟带毒传入引发的可能性较大;未开展禽流感免疫接种,未建立起有效的免疫保护屏障,是此次疫情发生的内因。经科学处置,疫情被扑灭,扩散风险低。疫情启示,扎实做好公园、动物园等观赏野禽饲养相关场所的禽流感强制免疫工作,切实筑牢野禽及家禽禽流感免疫保护屏障,对降低禽流感疫情发生风险具有重要意义。