MDRV和H9AIV共感染对B淋巴细胞增殖功能的影响

以番鸭呼肠孤病毒(MDRV)或/和H9亚型水禽流感病毒(AIV)人工感染8日龄健康雏番鸭,应用MTT法测定感染后7、14和21d番鸭血液、脾脏和法氏囊中的B淋巴细胞增殖功能的变化动态,探讨MDRV或/和H9亚型AIV对B淋巴细胞增殖功能的影响。结果显示8日龄番鸭人工感染后,MDRV感染、AIV感染和共感染组番鸭血液、法氏囊和脾脏的B淋巴细胞刺激指数均明显低于健康对照组,而且共感染组番鸭B淋巴细胞刺激指数低于MDRV感染和AIV感染组,表明MDRV和H9AIV病毒感染均能抑制番鸭外周血液及体液免疫器官(法氏囊、脾脏)中B淋巴细胞增殖功能,MDRV与H9AIV共感染加重B细胞免疫抑制程度。

1例蛋鸡混合感染的病原检测与分析

为明确盐城某规模化养殖场蛋鸡死亡原因,针对2022年冬季送检的17只患病蛋鸡进行了病理剖检、细菌分离鉴定和常规PCR检测。细菌分离鉴定结果表明分离到1株致病性大肠杆菌;PCR检测结果包括H9亚型AIV 1份、CAV 4份、MDV和CAV混感1份、FAdV和CAV混感1份、H9和CAV混感6份。结合临床症状、病理变化和实验室检测结果,该次疫情诊断为CAV、H9亚型AIV、FAdV、MDV和EC混合感染。

血凝素蛋白145位潜在糖基化位点对H9N2禽流感病毒生物学特性的影响

从某肉鸡场分离的A/Chicken/Jiangxi/106/2012(H9N2)(JX106)毒株,其HA蛋白在145位氨基酸由S突变为N,使得在该处增加了一个潜在的糖基化位点NGT。本研究以JX106为研究对象,通过反向遗传操作获得重组病毒rgJX106-HA145N和rgJX106-HA145S。利用不同方法探究了HA蛋白145位糖基化位点对病毒的毒力、复制、受体亲和力和致病性等方面的影响。研究发现,rgJX106-HA145N和rgJX106-HA145S在A549细胞上的复制、对鸡胚的感染力无明显差异,而HA蛋白145位无糖基化位点的rgJX106-HA145S与α2,6-唾液酸受体的亲和力更强,在小鼠肺脏中复制更快、致病力更强且能产生更高的交叉HI效价,这一结果提示流感病毒血凝素的糖基化对病毒诱导的体液免疫具有重要影响。

宁夏部分地区H9亚型禽流感病毒HA基因演化分析

为了解宁夏地区H9亚型禽流感病毒的流行情况与分子遗传学特征,2022年4—6月在宁夏养禽业集中的6个县(市、区)共采集1 240份咽喉/泄殖腔拭子,采用实时荧光定量PCR进行AIV核酸检测,并对RT-PCR扩增的HA基因阳性产物进行测序分析及生物信息学分析。结果表明,参试样本中总AIV阳性率为9.84%,其中H9亚型阳性率为7.59%;HA蛋白裂解位点分析发现氨基酸序列均为PSRSSR的非连续性碱性氨基酸的插入,符合低致病性禽流感特征,且均发生Q234L突变(H9编码),具有与人流感受体唾液酸α-2,6-受体结合的特性;生物信息学分析显示H9亚型AIV毒力和致病力等生物学特性有趋于转强的可能性,经过基因重排可能会进化出新的禽流感亚型或分支。因此,在禽类养殖过程中,必须对H9亚型AIV加以重视并加强预警,严格做好监测防控工作。

利用8质粒系统拯救A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)株禽流感病毒

应用反向遗传技术将含有1998年中国大陆分离株H9N2亚型禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)的8个基因片段的质粒共转染COS_1细胞,产生了与野生病毒生物学特性相同的H9N2亚型AIV。将A Chicken Shanghai F 98(CK SH F 98)株H9N2亚型AIV的8个基因组cDNA分别克隆到polⅠ_polⅡ转录 表达载体pHW2 0 0 0中,构建成8个转录表达载体重组质粒。将这8个质粒共转染COS_1细胞,2 4h后收获细胞及上清接种SPF鸡胚,4 8h后收取鸡胚尿囊液继续进行鸡胚传代,产生能致死鸡胚的病毒。经血凝、血凝抑制试验、序列分析和电镜观察,证实产生了CK SH F 98(H9N2 )株AIV。

H5、H9亚型禽流感病毒及鸭坦布苏病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种能同时快速检测H5、H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)的多重PCR检测方法,根据GenBank发表的H5、H9亚型禽流感病毒(AIV)HA基因和DTMUV的NS5基因序列,分别设计了3对特异性引物,通过优化扩增条件,建立了同时检测H5亚型AIV、H9亚型AIV和DTMUV的多重PCR检测方法,对其特异性及敏感性进行检验,并在临床中进行初步应用。结果表明,该多重PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可同时扩增出大小分别为732bp(H9亚型AIV)、380bp(H5亚型AIV)、250bp(DTMUV)的特异片段,利用本试验建立的多重PCR对其他鸭病病原体进行扩增结果均为阴性,利用这3对引物对H5、H9亚型AIV和DTMUV进行敏感性检测,结果显示最低检测极限分别为533pg·μL-1、56pg·μL-1和6.6ng·μL-1。对临床200份样品的检测结果表明该多重PCR检测方法具有快速、敏感、特异性强等优点,适用于临床检测应用。

不同接种途径对H9亚型禽流感病毒在SPF鸡的致病性

目的探讨H9亚型AIV不同接种途径对SPF鸡致病性的影响。方法以气管接种和静脉接种途径对SPF鸡进行人工感染。结果气管接种组死亡率为16.7%,而静脉接种组未见死亡;称重发现气管接种组平均体重显著低于静脉接种组;跟踪泄殖腔排毒发现气管接种组试验鸡排毒率高于静脉接种组,排毒时间也长于后者;病理切片观察可见气管接种组病变严重,恢复期长;在免疫组化试验中,气管接种组可在肺中检测到病毒存在,而静脉接种组各组织中均未检测到病毒的存在。结论气管接种H9亚型AIV组比静脉接种组致病性更强,是评价H9亚型AIV致病性更为有效的接种途径。

抗H9N2 AIV HA单克隆抗体的制备及其在胶体金层析检测中的初步应用

用基因疫苗pcDNA-H9和纯化H9N2亚型AIV免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用HI和ELISA方法筛选出5株抗H9亚型AIV HA的特异性单克隆抗体H9-01(2E6),H9-02(3B1),H9-03(3H11),H9-04(1A4),H9-05(2G9)。各株单抗亚型测定的结果为H9-01,H9-02和H9-05均为IgG2b,H9-03为IgG1,H9-04为IgG2a,轻链的亚型均为kappa链。经特异性和与同型病毒的反应谱检测,它们均是HA特异性单克隆抗体。用制备的抗H9亚型AIV HA的单克隆抗体做成胶体金层析检测试纸条,可以检测到200个EID50的H9亚型AIV,为监测该亚型AIV试剂盒的进一步商品化奠定了基础。

HH9N2 AIV对小鼠肠道菌群结构及黏膜屏障功能的影响研究

为研究H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)继发细菌感染的作用机制,以BALB/c小鼠为模型,研究呼吸道感染H9N2 AIV后,宿主肠道菌群结构、黏膜屏障、黏膜炎症反应等情况。结果显示:H9N2 AIV经呼吸道感染BALB/c小鼠后,小鼠肠道菌群紊乱。攻毒后小鼠体内的葡萄球菌属、链球菌属和棒状杆菌属极显著增加(P<0.01),而有益菌为主的乳杆菌属等极显著降低(P<0.01);H9N2 AIV感染小鼠后,肠道黏膜屏障被破坏,促炎因子IFN-γ、IFN-β等极显著高表达(P<0.01),上皮细胞中的ZO-1等紧密连接蛋白则明显下调(P<0.05),造成肠壁通透性增强。研究表明小鼠感染H9N2 AIV后,其肠道微生物菌群失衡、黏膜屏障功能被破坏、出现炎症反应等。

金丝桃素蛋白络合物在鸡体内对H9N2亚型禽流感病毒杀灭效果的研究

为了明确金丝桃素蛋白络合物在动物体内对H9N2亚型AIV的杀灭效果及临床上用于预防和治疗的剂量,将180只28日龄非免疫石歧杂黄鸡随机分为6组,分别为金丝桃素蛋白络合物高、中、低剂量组,金刚烷胺药物对照组,感染不给药组及健康对照组。其中,金丝桃素蛋白络合物三个剂量组的实验鸡于感染H9N2亚型AIV12h后分别以不同的剂量灌服给药,而金刚烷胺药物组于攻毒12h后以100mg/l饮水。用棉拭子采集各实验组鸡的咽喉及泄殖腔黏液,进行微量血凝(HA)试验及RT-PCR检测,以确定各实验组鸡的排毒情况。结果表明,金丝桃素蛋白络合物对人工感染H9N2亚型AIV的实验鸡有较好的保护作用,与金刚烷胺药物对照及感染不给药组相比有显著差异。

应用RT-PCR和病毒学方法检测低致病力禽流感感染的研究

分别应用病毒分离和鉴定试验以及禽流感病毒(AIV)型特异性RT-PCR技术,对疑似H9亚型AIV感染的10份病死鸡组织病料进行了实验室诊断。结果有7份病例用上述两种方法检测均为阳性;2份病料仅分离到H9亚型AIV;1份病例仅H9亚型RT-PCR阳性。研究表明,对于H9亚型AIV临床组织样品的检测,病毒分离试验的敏感度高于RT-PCR。当检测因运输或消毒药物作用而导致病料中病毒死亡的H9亚型AI临床病例时,RT-PCR有明显的优势。将RT-PCR和病毒分离鉴定两种方法相结合,可提高临床样本的H9亚型AIV的检出率。

抗H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的制备及亚型鉴定

用基因疫苗pcDNA-H9、纯化H9N2亚型AIV和重组噬菌体T4-H9HA免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用HI和ELISA方法筛选出5株抗H9亚型AIV HA的特异性单克隆抗体H9-01(2E6)、H9-02(3B1)、H9-03(3H11)、H9-04(1A4)、H9-05(2G9)。各株单抗亚型测定的结果为H9-01、H9-02和H9-05均为IgG2b,H9-03为IgG1,H9-04为IgG2a,轻链的亚型均为kappa链。经特异性和与同型病毒的反应谱检测,它们均是HA特异性单克隆抗体。为进一步分析H9N2亚型AIV的结构与功能以及建立监测该亚型AIV的试剂盒奠定了基础。

苦参碱对H9N2 AIV感染小鼠NLRP3炎性体信号通路的影响

【目的】流感病毒感染引发机体的炎症反应及免疫稳态失衡,由此产生的细胞因子风暴(CS)是引起感染宿主死亡的主要原因。通过探究苦参碱对H9N2 AIV感染小鼠的保护作用及其调节NLRP3炎性体信号通路的特点及作用机制,可进一步完善中药抗病毒的理论依据,为新型抗病毒药物的研发奠定基础。【方法】72只8周龄BALB/c小鼠随机分为空白组(0.1 mL无菌鸡胚尿囊液)、病毒组(0.1 mL 4×10^(5)PFU/mLH9N2 AIV)、金刚烷胺组(0.1 mL 4×10^(5)PFU/mLH9N2 AIV+100×10^(-6)99%金刚烷胺)、苦参碱高浓度治疗组(0.1 mL 4×10^(5)PFU/mLH9N2 AIV+40 mL·kg^(-1)苦参碱)、中浓度治疗组(0.1 mL 4×10^(5)PFU/mLH9N2 AIV+20 mL·kg^(-1)苦参碱)和低浓度治疗组(0.1 mL 4×10^(5)PFU/mLH9N2 AIV+10 mL·kg^(-1)苦参碱),每组12只,含病毒鸡胚尿囊液滴鼻构建小鼠病毒性肺炎模型,灌服或饮水给药治疗连续5 d,试验共进行7 d,观察不同组小鼠的体重变化。在第1、3、5、7天分别取3只小鼠无菌采血并处死,取小鼠肺组织进行病理组织学观察,RT-PCR检测小鼠肺组织中H9N2 NA、NLRP3 NLR基因表达情况,Western Blot检测苦参碱治疗后H9N2感染小鼠肺组织NLRP3炎性体信号通路相关蛋白表达量的变化,小鼠血清用ELISA法测定细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-10表达量的变化。【结果】与病毒组相比,苦参碱高浓度治疗组病理组织学观察中H9N2 AIV感染小鼠肺部水肿的区域明显减少,红细胞渗出减少,炎性细胞数量减少,效果接近金刚烷胺组。7 d时苦参碱高浓度治疗组小鼠肺泡壁完好,肺泡之间分界清楚,肺组织内炎性细胞、浆细胞数量大量减少,与空白组无异;苦参碱中浓度治疗组肺组织少量出血,肺泡内无渗出液,肺泡间隔完好;苦参碱低浓度治疗组可见肺泡内红细胞渗出,大量浆细胞募集,肺泡之间出现融合现象。经过苦参碱和金刚烷胺治疗的各组小鼠肺组织中H9N2病毒基因表达量在3、5和7 d极显著降低(P<0.01)。经治疗3、5 d时,苦参碱高浓度治疗组和金刚烷胺组的NLRP3基因和蛋白表达量、TNF-α、IL-1β蛋白表达量极显著降低(P<0.01);7 d时,苦参碱高、中、低治疗组小鼠肺组织中NLRP3基因表达量极显著降低(P<0.01);5 d时苦参碱低浓度治疗组NLRP3蛋白、Caspase-1蛋白和中浓度组Caspase-1蛋白表达量显著降低(P<0.05);3 d、5 d时苦参碱中、低浓度治疗组TNF-α和IL-1β蛋白表达量极显著降低(P<0.01),苦参碱中浓度治疗组IL-10表达量极显著降低。【结论】苦参碱可在体内抑制H9N2 AIV的表达,通过下调NLRP3炎性体信号通路相关蛋白,下调TNF-α、IL-1β和IL-10的表达,减轻炎症反应,有良好的抗病毒、抗炎作用。

H9N2亚型禽流感病毒SD18株的传染性及不同途径感染效果比较

【目的】研究H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)对哺乳动物的传染性和致病性。【方法】采集样品进行病毒的分离鉴定,将分离到的病毒以300μL/只(10^(7) EID_(50))的剂量通过滴鼻和肺递送方式感染豚鼠,每组各15只,对2组感染效果进行比较,然后通过分离株在豚鼠中的传播能力试验验证其气溶胶传播能力,通过间接免疫荧光试验检测分离株在人支气管上皮细胞上的复制能力。【结果】试验分离到1株H9N2亚型AIV,命名为SD18,病毒通过肺递送和滴鼻2种攻毒方式感染豚鼠后,肺递送组的排毒量显著高于滴鼻组(P<0.05)。通过对豚鼠肺脏相关模式识别受体和抗病毒蛋白的表达检测发现,2种攻毒方式都能诱导相关的免疫因子Toll样受体3(TLR3)、TLR7、抗黏病毒蛋白(MX)和2′,5′-腺苷酸激酶(OAS)表达量极显著上调(P<0.01);2组在攻毒后第6天产生抗体,并呈上升趋势。对SD18株在豚鼠中的传播能力验证发现,SD18株具有通过直接接触和飞沫传播感染豚鼠的能力,但并未证实气溶胶的产生和传播。对SD18株感染人支气管上皮细胞BEAS-2B后发现,在感染后12 h可检测到病毒,24 h时病毒在细胞内复制能力最强,TLR3、TLR7、MX、OAS、白介素6(IL-6)、IL-8、干扰素-β(IFN-β)相关的免疫因子表达量极显著上调(P<0.01)。【结论】H9N2亚型AIV SD18株的跨种传播能力变强,具有不经提前适应便可直接感染豚鼠的能力;SD18株具有通过飞沫传播感染豚鼠并使其产生抗体的能力且SD18株可在人支气管上皮细胞BEAS-2B上进行复制。

H9N2亚型AIV全基因序列分析及重组病毒R01/NASS气源性传播的特点

为了研究H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)气源性传播的分子机制,本研究以1株2008年山东省分离的H9N2亚型AIV为研究对象,对其全基因组序列进行分子特性和遗传进化分析;利用反向遗传操作技术,对具有气源性传染能力的山东分离株(SD01株)和不具有气源性传染能力的广东分离株(SS94株)进行重组,转染细胞拯救出重组株R01/NASS,对其在鸡群间的气源性传染能力进行测定。对SD01株序列分析表明,SD01株的M、NS、NP和HA基因与HK/G9/97相似性最高,NA、PB1和PB2基因与HK/Y280/97相似性最高,PA基因与SH/F/98相似性最高。病毒在SPF鸡群间传播性试验发现,重组病毒R01/NASS接种鸡群后,可以经直接接触途径传染鸡群,但是却未感染气溶胶被动感染组鸡群,表明NA基因的替换使病毒失去了气源性传染的能力。该试验结果为从分子水平上深入研究SD01株AIV NA蛋白氨基酸位点与气源性传染的关系提供了理论依据。

海藻硫酸多糖和中药复方对鸡胚接种H9N2亚型禽流感病毒的作用

为探讨海藻硫酸多糖(sulfated polysaccharide from algae,SPA)及中药复方提取液(compound extracts of Chinese medicine,CECM)对H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的作用,将SPA及CECM以3种不同加药方式作用于接种了H9N2亚型AIV的10日龄SPF鸡胚中,无菌收集鸡胚尿囊液,测定血凝效价,检测2种药液对H9N2亚型AIV的预防、治疗及直接灭活作用。结果显示,SPA及CECM的最大安全浓度分别为50和200mg/mL;3种不同加药方式下,不同浓度SPA及CECM均能极显著降低鸡胚尿囊液中H9N2亚型AIV的血凝效价(P<0.01),以直接灭活作用组的血凝效价降低幅度最大,预防作用组和治疗作用组次之。预防作用组,CECM高剂量组(200mg/mL)的抗病毒效果显著优于SPA各剂量组(12.5、25和50mg/mL)及CECM低、中剂量组(50和100 mg/mL)(P<0.05);治疗作用组,SPA高剂量组(50 mg/mL)及CECM中、高剂量组(100和200mg/mL)抗病毒效果显著优于SPA低剂量组(12.5mg/mL)(P<0.05);直接灭活作用组,SPA及CECM的抗病毒效果均佳,CECM各剂量组的抗病毒效果与SPA各剂量组差异极显著(P<0.01)。结果表明,SPA和CECM对10日龄鸡胚几乎无毒副作用;SPA及CECM均能显著抑制H9N2亚型AIV在鸡胚尿囊液中的增殖,以直接灭活作用组的抗病毒效果最佳,其抗H9N2亚型AIV作用的强弱与药物浓度、用药和病毒的感染时间顺序密切相关。

1株H7N9亚型禽流感病毒的遗传进化和分子特征分析

对1株H7N9亚型禽流感毒株A/environment/Hebei/621/2017(H7N9)简称EN621进行基因测序和序列分析,研究其遗传进化趋势和分子生物学特征。结果显示,该毒株血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)分别与人源流感毒株的HA和NA属于同一进化支进化而来,EN621毒株HA蛋白的裂解位点存在多个连续碱性氨基酸,符合典型高致病性AIV特征;HA蛋白上有4个糖基化位点与人源流感毒株HA蛋白糖基化位点一致,且第226位氨基酸为Q,优先与禽类α-2,3唾液酸受体结合;NA蛋白上有6个潜在糖基化位点与人源流感毒株NA蛋白糖基化位点一致;NP蛋白第184氨基酸位点由A突变为K,对于AIV的复制和致病性有着密切联系。本研究提示EN621毒株存在感染人的潜在可能性,应加强H7N9亚型禽流感病毒的监测,建立相应的防范机制,保障公共安全。

我国H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白145和153位抗原位点变异分析

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)易发生抗原漂移,但识别我国H9N2亚型AIV流行株抗原差异性的关键抗原位点还不清楚。选取两株血凝抑制(HI)效价高的H9N2亚型AIV单克隆抗体2E4与2D6对A/Chicken/Shanghai/F/1998(H9N2)毒株施加抗体压力制备单抗逃逸突变株,鉴定抗原位点;利用单抗对2017—2019年H9N2亚型AIV代表株进行HI抗原谱分析,确定抗原位点与基因分型关系;分析我国H9N2亚型AIV相应抗原位点的变异规律。结果显示:单抗2E4与2D6分别识别HA头部的145位和153位抗原位点;2017—2019年华东地区H9N2亚型AIV分离株根据HA基因遗传进化树可分为Group 1和Group 2两大分支,Group 1代表株与两株单抗反应性好,而Group 2代表株与两株单抗反应性差,序列分析发现已发生S145D(16/16)和D153G(15/16)的突变;通过对我国1996—2021年禽源H9N2亚型AIV HA蛋白位点自然突变率分析发现,含HA蛋白145D和153G的毒株占比分别上升至68%和66%,成为优势流行株。单抗2E4可用于当前H9N2亚型AIV的抗原分型,抗原位点145位是鉴别Group 1和Group 2抗原群差异的分子靶标之一。

广西边境地区家禽H9亚型流感病毒调查

为了解中越边境地区H9亚型禽流感病毒(AIV)的流行情况,本研究收集2012年12月～2015年12月广西边境地区主要活禽市场和养殖场的家禽拭子及环境样品,采用病原分离和鉴定方法对样品进行了分析。结果显示,H9亚型AIV整体分离率为3.01%,其中冬春季节(3.47%)高于夏秋两季(1.39%);市场样品的病毒分离率(3.73%)高于养殖场(1.53%);在鸡、鸭、鹅源样品中均能检测到H9亚型AIV,其中鸡源样品的H9亚型AIV分离率最高(7.68%),鹅次之(1.43%)。本研究表明,H9亚型AIV在广西边境地区表现出一定的时间、空间和群间分布特征。本研究对H9亚型AIV进行跟踪监测可为预防和控制禽流感提供重要的流行病学信息。

H9N2亚型禽流感病毒流行病学研究进展

H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)在我国已有二十多年的流行历史,且在我国鸡群中广泛传播,给家禽养殖业造成了巨额损失;H9N2亚型AIV感染人事件的报道也屡见不鲜,给公共卫生带来了巨大的压力和挑战。为了有效控制H9N2亚型AIV的流行和传播,降低其感染风险,文章从流行特点、分子适应机制、感染宿主范围以及防控措施等方面对H9N2亚型AIV的流行病学进行了系统阐述,在阐明H9N2亚型AIV的流行规律及趋势的同时,概述了其分子致病机制,并初步评估了其进化方向和风险性,为AIV的综合防控提供参考依据和理论支持。