不同H9N2亚型禽流感病毒分离株致病力研究及HA抗原性变异分析

【目的】了解近年来中国H9N2亚型禽流感病毒毒力变化和抗原性变异的特点,【方法】对分离于1998—2008年间的25株H9N2亚型禽流感病毒分离株进行了EID50、ELD50、MDT、ICPI、IVPI和8周龄SPF鸡人工感染排毒试验,测定了部分分离株与抗H9N2亚型禽流感病毒Hp参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制(HI)和中和反应特性,对具有不同反应特性分离株的HA基因进行了序列分析。【结果】不同分离株呈现致病力差异,具多态性特征,3#、12#和14#分离株致病力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,人工感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长。3#和12#分离株与单抗2A4和F6呈现特殊的反应特性,单抗不能抑制3#和12#的血凝特性,也不能中和病毒感染CEF细胞。HA蛋白氨基酸序列分析表明,3#和12#分离株145位氨基酸发生漂变(S→N),导致与单抗的血凝抑制反应特性丢失,说明该位点(S145)为H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的一个抗原表位,是血凝抑制抗体结合位点。S145N的漂变导致在145—147位氨基酸多出一个糖基化位点NGT,可能是分离株毒力增强的原因。【结论】本研究结果表明,H9N2亚型禽流感病毒呈现变异趋势,出现了有致病力和抗原性变异流行毒株。S145为H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的一个抗原表位,但有该位点漂变导致的抗原变异毒株出现,并可逃避免疫作用,对该病的防控提出了新的挑战。

H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白S145N变异株致病性及抗原特性

为确定近年来H9N2亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白S145N点突变对病毒毒力变化和抗原性变异的影响,笔者对从全国不同地区分离的12株H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株和HP疫苗参考株进行了半数鸡胚感染量(EID50)、半数鸡胚致死量(ELD50)、平均鸡胚致死时间(MDT)、雏鸡脑内致病指数(ICPI)、鸡静脉致病指数(IVPI)和8周龄SPF鸡感染排毒试验,并与抗H9N2亚型AIV HP参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制(HI)和中和反应特性进行测定。结果发现,H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株毒力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长。单抗2A4和F6不能抑制H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株的血凝特性,也不能中和病毒感染CEF细胞。研究结果表明,H9N2亚型AIV呈现变异趋势,有毒力增强和抗原性变异毒株出现。S145为H9N2亚型AIV HA蛋白的1个抗原位点,是血凝抑制抗体结合的位点,但有该位点漂变导致抗原变异毒株出现,并可逃避免疫作用。这提示该病的防控面临着新的挑战。

MDV和AIV主要保护性抗原基因在鸡痘病毒中的联合表达

将强启动子Ps插入载体7S中构建成插入载体7SP,将鸡马立克氏病病毒(MDV)糖蛋白B(gB)基因和禽流感病毒(AIV)血凝素H9A基因共同克隆到插入载体7SP中,获得重组转移质粒7SPGA,通过酶切鉴定获得Ps-gB与P7.5-HA同向的转移质粒,再将报告基因盒PL11-LacZ插入转移质粒7SPGA得7SPLGA,将质粒7SPLGA与禽痘病毒疫苗株共转染鸡成纤维细胞,通过蓝白斑筛选纯化得到重组病毒rFPV-Ps-gB-P7.5-HA,以间接免疫荧光法证实gB基因和HA基因同时得到表达。该研究为探索新型基因工程苗打下了良好的基础。

流感疫苗血凝素含量测定替代方法的建立及验证

目的建立测定流感疫苗血凝素（Haemagglutinin,HA）含量的替代方法 ,并进行验证,以解决大流行流感发生初期疫苗原液中HA定量的难题。方法优化糖苷酶处理条件,将流感疫苗原液经糖苷酶处理后,以还原SDS-PAGE方法分离样品,以灰度扫描法确定HA蛋白百分比,结合样品总蛋白数值,计算样品中HA含量。以该方法和传统的单向免疫扩散（SRID）法分别测定7批流感疫苗原液中HA含量,并进行比较。结果优化的糖苷酶处理条件为：总蛋白400μg/ml,PNGaseF加入比例为1：50。样品经糖苷酶处理后,以还原SDS-PAGE法可以清晰区分各蛋白条带,经测序后确定HA两个亚基,与预期相对分子质量一致。该方法测定7批流感疫苗原液中HA含量的结果与SRID法测定结果的符合率在87.90%~122.20%之间。结论初步建立了测定流感疫苗中HA含量的替代方法 ,在WHO参考品供应不到位时,可用于大流感发生时疫苗原液中HA之定量。