HA-1树突状细胞核酸疫苗的构建及其特异性CTL的诱导

本研究以次要组织相容性抗原HA-1为靶点,构建HA-1树突状细胞核酸疫苗用于造血干细胞移植后抗白血病治疗。体外培养移植供者树突状细胞,用流式细胞术、混合淋巴细胞反应检测其免疫活性,通过电转法将HA-1基因转染树突状细胞,构建树突状细胞核酸疫苗。48小时后检测HA-1蛋白表达情况。将转染后的树突状细胞与同基因淋巴细胞共孵育诱导特异性CTL,应用LDH释放实验检测其体外杀伤活性。结果表明经外周血单核细胞诱导的树突状细胞表达树突状细胞表型,能刺激同种淋巴细胞增殖。电转48小时后,Westernblot可检测到HA-1蛋白表达。诱导的CTL体外杀伤活性高于对照组。结论次要组织相容性抗原HA-1可作为造血干细胞移植后抗白血病治疗的靶点。

H1N1猪流感病毒广西分离株HA基因序列分析

【目的】了解H1N1猪流感病毒广西分离株的分子特征,为广西猪流感疫情监控提供参考依据。【方法】采用RT-PCR对2011年分离获得的H1N1猪流感病毒广西分离株（A/swine/Guangxi/1/2011）的HA基因进行扩增,然后利用DNASTAR分析软件对测序基因片段进行整个阅读框架的核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性比对分析,并用MEGA4.0绘制遗传进化树。【结果】广西分离株HA基因长1701bp,编码566个氨基酸,核苷酸序列与经典SIV的同源性为88.0%~99.6%,与季节性H1N1人流感病毒的同源性为76.3%~77.3%,与欧洲类禽SIV分离株的同源性为72.9%~75.4%,与2009甲型H1N1流感病毒的同源性为99.2%~99.6%;从核苷酸遗传进化树可知,广西分离株与类禽H1N1流感病毒和人H1N1流感病毒分离株的亲缘关系较远,而与2009甲型H1N1流感病毒分离株的亲缘关系最近。广西分离毒株HA基因的裂解位点序列为IPSIQSR↓G,具有典型低致病性流感病毒的分子生物学特征;共有8个糖基化位点,其中6个位于HAl区,两个位于HA2区;广西分离株HA蛋白RBS位点的氨基酸同时具有人和猪流感病毒的特点。【结论】广西分离株（A/swine/Guangxi/1/2011）属于2009甲型H1N1流感病毒。

云南省2009年至2014年B型流感毒株血凝素基因进化分析

目的了解云南省2009年至2014年B型流感病毒血凝素(HA1)基因突变及其抗原变异情况.方法将云南省2009年至2014年流感哨点监测医院采集的流感样病例咽拭子进行病毒分离,随机抽取12株B型流感病毒进行HA1基因序列测定,并对测序产物进行分析,通过MEGA软件进行同源性比对、构建HA基因进化树.结果云南省流感毒株血清型和基因型鉴定有差异,可能是由于基因变异后量的积累量不够引起.在HA1蛋白的抗原决定簇的3个重要区域120环,150环和160环都有氨基酸的变异.云南省流感毒株在120环的131位置氨基酸变异为N131K,137位置B-Victoria系氨基酸发生了N137H的变异,187位置有2株发生了P187S的变异.结论云南省的B型流感毒株在血凝素基因重要位置发生了多处变异,有和疫苗株相同的变异,也有不同于疫苗株的变异.

甲_1型流感病毒新分离株HA基因的序列分析

目的研究新分离的 H1 N1 亚型流感病毒株的 HA1基因序列。方法甲型流感病毒通过鸡胚增殖后提取 RNA、逆转录合成 c DNA,经 PCR扩增和产物纯化构建重组质粒 ,用双脱氧链终止法进行核苷酸序列测定并进行基因特性分析。结果新分离到的 3株流感病毒株 (H1 N1 ) HA 1区基因长度为 981bp,编码 32 7个氨基酸 ;与 A/桂防 / 10 / 94和 A/ Bayern/ 0 7/ 95(H1 N1 )标准株比较其同源性分别为 92 .8%和 91.3% ,丢失了第 130位氨基酸和 30 4位糖基化位点 ;新分离的 3株甲型流感病毒株 (H1 N1 ) HA1区氨基酸同源性高达 98% ;A/桂防 / 10 / 94和 A/ Bayern/ 0 7/ 95 (H1 N1 )毒株 HN1氨基酸的同源性高达 96 %。结论新分离到的 3株 H1 N1 毒株 HA编码氨基酸不同于 A/ Bayern/ 0 7/ 95 (H1 N1 )和 A /桂防 / 10 / 94(H1 N1 )标准株 。

H1亚型猪流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达及其间接ELISA方法的初步建立

根据GenBank发表的H1亚型猪流感HA基因序列设计引物,扩增出HA基因片段,将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67B-H1,转化含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体获得重组转座子(rBacmid-H1),在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBV-H1),再感染细胞,收获目的蛋白。通过血凝试验、免疫印迹法、免疫组化分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物学活性。利用表达的蛋白作为猪流感间接ELISA的抗原,初步建立H1亚型猪流感的间接ELISA检测方法,并对内蒙古、辽宁和黑龙江等地送检的93份猪血清进行了检测,阳性率为31.18%,为研制开发快速、准确、简便的H1亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定基础。

1998～1999年浙江省甲3型流感病毒代表株HA_1序列比较

目的 对浙江省 1998年初至 1999年底流行的甲3 型流感病毒的不同血凝特性进行分析。方法 采用对甲3 流感病毒的血凝素基因HA1 进行核苷酸序列测定。结果 占我省分离株主流的对鸡红细胞不凝集的O相代表株A/浙江 6 /99其HA1 区域与当年的国际标准株A/武汉 /35 9/95血清学交叉HI试验抗原比为2 2 6 ,两者的氨基酸同源性仅为 94 82 % ,存在较大差异 ,而在分离中占极少数的对鸡红细胞凝集的D相代表株A/浙江 /10 /98与A/武汉 /35 9/95的血清学交叉HI试验抗原比为 0 7,两者的同源性为 99 7% ,几乎无差异。结论 近年我省甲3 型流感流行的主要原因 ,是由于流感病毒在免疫压力下在HA1

H7亚型禽流感病毒HA1基因的克隆与原核表达

利用PCR技术亚克隆了H7亚型禽流感病毒的HA1基因,并将PCR产物连接到克隆载体pMD 18-T Simple vector,转化大肠杆菌。测序结果表明所克隆的片断大小为1035bp。将HA1基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,经酶切和PCR鉴定,证明成功构建了重组表达载体pGEX-HA1。将构建好的融合表达载体在IPTG的诱导下在大肠杆菌中得到了表达。融合蛋白GST-HA1的分子量为63ku。Western-Blot和ELISA鉴定结果表明,融合蛋白与H7亚型禽流感阳性血清发生特异性反应,而与H5、H9亚型抗血清不发生反应。

AEG-1在恶性肿瘤中的研究进展

星形胶质细胞升高基因(Astrocyte elevated gene-1,AEG-1)最初通过快速消减杂交技术(rapid subtraction hybridization,RaSH)鉴定发现,在HIV-1或肿瘤坏死因子-α诱导的原代人胎脑星形胶质细胞(primary human fetal astrocvtes,PHFA)中其表达升高。AEG-1的cDNA由3 611个碱基组成,定位于8q22,分子量64kDa,等电点是9.33。研究发现,AEG-1定位于核周和类内质网结构区。AEG-1是Ha-ras和c-myc的下游靶分子。此外,近几年研究证实,AEG-1的致癌作用与激活PI3K-Akt和NF-κB信号通路有关。AEG-1最初在2002年被成功克隆,目前已被证实在多种器官的致癌作用过程中发挥关键作用。AEG-1在神经母细胞瘤、乳腺癌、肝癌和前列腺癌等多种恶性肿瘤中高表达,且与患者的生存率负相关。在体内、外通过提高或抑制AEG-1表达的研究进一步探明AEG-1调节细胞的多种生理、病理过程,包括增殖、侵袭、转移、血管新生和基因表达等。虽然AEG-1的致癌作用已经得到证实,但它作为一个癌基因的潜在功能和作用机制需要进一步探讨。本文就AEG-1与恶性肿瘤的关系做一综述,旨在以AEG-1为合理的靶点介入肿瘤治疗提供新的视野。

禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)纤维素结合蛋白基因(Ha-cbp-1)的克隆和序列分析

禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)是中国小麦上的重要病原线虫。纤维素结合蛋白基因是一种重要的植物线虫寄生和致病相关基因。用同源克隆的方法从禾谷孢囊线虫寄生前二龄幼虫中克隆出一种纤维素结合蛋白新基因Ha-cbp-1(GenBank注册号GQ178086)cDNA序列。Ha-cbp-1基因cDNA包含1个开放阅读框,编码131个氨基酸残基的蛋白质,预测蛋白由1个长度为18氨基酸残基的信号肽和1个纤维素结合区域(CBD)组成。Ha-cbp-1的基因组DNA序列含有2个内含子。预测的禾谷孢囊线虫纤维素结合蛋白(HA-CBP-1)序列与大豆孢囊线虫纤维素结合蛋白(HG-CBP-1)序列有60%的同一性和76%的相似性,与甜菜孢囊线虫纤维素结合蛋白(HS-CBP-1)序列有60%的同一性和75%的相似性。本研究首次从禾谷孢囊线虫中成功克隆出CBP蛋白基因。

一起流感暴发流行的病原学研究

目的:对2007年6月上旬深圳市龙岗区某工厂流感暴发流行的病原学进行分离并鉴定和分子流行病学研究。方法:采集发热患者的鼻咽拭子和急性期患者血清,采用荧光定量RT-PCR方法进行核酸检测,用MDCK细胞对病人的咽拭标本进行分离培养,并对分离到的流感病毒HA l基因核苷酸序列进行测定及抗原分析,同时检测了患者的血清抗体水平。结果:27份鼻咽拭子标本中荧光定量RT-PCR检测阳性17份,阳性率为63.0%(17/27);MDCK细胞分离培养,其中2份鼻咽拭子标本中分离出2株H3N2亚型流感病毒,阳性率7.4%(2/27);6例病人的双份血清学检测结果显示:恢复期抗体比较急性期抗体有4倍或以上增长。另将其中1株的HA l基因测序,与国家代表株及2006、2007年WHO推荐的疫苗株进行比较,发现在HA蛋白的A、B或C抗原决定簇上出现氨基酸发生变异,表明分离到的流感病毒发生HA蛋白抗原漂移。结论:这起发生抗原漂移H3N2亚型流感病毒造成这次流感暴发的流行。