HAL1基因转化番茄及耐盐转基因番茄的鉴定

采用PCR方法 ,从啤酒酵母中扩增得到可调节植物细胞离子均衡的HAL1基因 ,克隆后序列分析表明 :其开放读码框全长 879bp ,编码一个 2 94个氨基酸的多肽 (分子量 3 2kD)。构建含HAL1和NptⅡ嵌合基因的植物表达框架pRH ,三亲杂交后经农杆菌介导的叶圆盘法转化番茄 (中蔬 5号 ) ,在含卡那霉素的培养基上进行转化体的筛选。转基因番茄的PCR、Southern杂交、RT PCR检测以及鲜重、干重和Na+ 、K+ 含量的测定表明 :HAL1基因确已整合到一些转基因番茄的基因组中 ;且转基因植株的耐盐性提高。

HAL1基因转化烟草及其耐盐性

利用含HAL1基因的高效植物表达载体pAHF转化根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens,LBA4 4 0 4 ) ,用农杆菌介导的叶圆盘法对烟草 (NicotianatabacumL .)叶片进行遗传转化。在含卡那霉素的MS分化培养基上选择转化体和植株再生 ,转化植株可在含卡那霉素的生根培养基中生根。经PCR检测发现 ,在 8个转化子中有 6个转化子获得特异性扩增条带。耐盐试验表明 ,在被检测的 90 0株转化子中有 4 81株可在含 0 .80 %～ 1.5 0 %NaCl的生根培养基中生根 ,生根率为 5 3.4 5 % ,对照烟草植株只在低于 0 .80 %NaCl的生根培养基中生根 ,生根率为 73.75 %。由此证明HAL1基因的转入提高了烟草的耐盐性。

转HAL1基因番茄的耐盐性

利用农杆菌介导的叶盘法 ,把HAL1基因转入番茄 ,Southern杂交检测得到转基因植株。耐盐实验表明 ,T1代转基因番茄在 15 0mmol/L的NaCl胁迫下仍有 4 3%的发芽率 ,2 0 0mmol/L的NaCl胁迫下发芽率为 6 % ,而对照种子在 10 0和 15 0mmol/L的NaCl胁迫下发芽率分别为 11.0 %和 0。转基因番茄的电解质相对外渗率小于对照 ,而根冠比和叶绿素含量大于对照 ,转HAL1基因显著提高了番茄的耐盐性。盐胁迫下Na+ 、K + 的累积状况表明 ,转基因番茄根、茎、叶的K+ /Na + 均有所提高 ,根系的SK/Na 增大 ,茎、叶的RSK/Na和RLK/Na减小 ,说明根系对K + /Na+ 离子的选择吸收和运输能力加强。不但选择吸收K + /Na+ ,而且表现出整株水平上的有利于耐盐的K + /Na+

HAL1基因转化苜蓿再生植株及其耐盐性

用根癌农杆菌介导法将克隆于酵母的HAL1基因转化龙牧803苜蓿胚性愈伤组织,经2 mg/L的Basta抗性筛选及PCR检测,该基因已整合到受体基因组中,共获得了11株转基因植株。培养基耐盐性实验结果:在添加NaCl的MSO培养基上,非转基因植株在NaCl浓度高于0.6%时不能生根,逐渐死亡;转基因植株在NaCl浓度0.6%～1.0%范围内仍能生根并正常生长。由此初步证明HAL1基因已在龙牧803苜蓿中表达,并且提高了耐盐性。

酿酒酵母HAL1基因的克隆及植物表达载体的构建

HAL1基因是酵母中重要的耐盐基因。以酿酒酵母AS2 .375菌株的DNA为模板 ,根据已发表的序列设计引物 ,经PCR扩增得到约 90 0bp的HAL1基因片段 ,连接到 pMD1 8 T载体上 ,转化大肠杆菌JM 1 0 9,筛选重组质粒进行酶切分析和序列测定 ,结果显示已克隆到完整的可读框 ,该基因的序列与已知序列同源性达 99%。将HAL1基因从T 载体上切下连接到pAM 1 94载体上构建了HAL1基因的植物表达载体 ,用于烟草的转化获得了耐盐性提高的转化植株。

耐盐基因HAL1的克隆及植物表达载体的构建

对编码调节离子转运蛋白的基因HAL1进行克隆、序列测定,并对植物表达载体进行构建。基因测序分析表明:该基因含有885个核苷酸,与GenBank上公布的HAL1基因的核苷酸同源性为99.30%,氨基酸序列同源性为99.32%。利用Hind 和Xba 切点插入质粒pBY505的Actin启动子与PIN终止子之间,构建成适宜于直接转化法转化植物的表达载体pBHAL1。

基因工程根瘤菌表达融合蛋白GST-HAL1条件的优化及耐盐水平的提高

利用原核表达载体pGEX-4T-1构建重组质粒载体pGEX-HAL1,三亲本杂交转化根瘤菌,表达融合蛋白GST-HAL1。结果表明,与空白菌和未诱导工程根瘤菌相比,诱导后工程根瘤菌的耐盐水平有明显提高。通过检测不同温度、不同诱导时间和不同IPTG诱导浓度条件下融合蛋白的表达量,优化各个参数。在28℃的温度条件下,融合蛋白GST-HAL1表达量明显增加;在IPTG浓度为1.0 mmol.L-1,诱导时间为3 h的条件下,融合蛋白的表达量最高,培养基产生的融合蛋白为3.02 mg.L-1,占可溶性蛋白质的39.34%。本研究对今后利用基因工程技术研制新型生物肥料做了有益的尝试。

秦烟遗传转化体系的优化

【目的】优化烟草的高效遗传转化体系。【方法】以陕西地区广泛种植的烟草品种秦烟98为试材，采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens，LBA4404）介导法，将从酿酒酵母细胞中克隆到的具有较强耐盐表型的HAL1基因进行遗传转化，对农杆菌介导的遗传转化条件及其影响因素进行研究。【结果】用50mg／L卡那霉素（Kan）筛选转化外植体用800mg／L羧苄青霉素（Cb）除菌可以获得理想的筛选和除菌效果。以优化的农杆菌介导烟草叶片的遗传转化条件为：将未经过预培养（预培养0d）的外植体用稀释150倍的农杆菌菌液（OD600=0．5）浸泡15min，转至MS1培养基上共培养48h，用无菌水冲洗后于体积分数2％NaCIO中浸泡15min，用无菌水冲洗4～5次，置800mg／LCb＋质量分数0．1％的甘露醇中浸泡约12h除菌。【结论】获得了农杆菌介导烟草叶片遗传转化的最佳优化条件，有效地减少了外植体的污染率，提高了抗性芽分化率。

酵母HAL1基因转化水稻及其耐碱性研究

利用农杆菌介导的遗传转化法,将从啤酒酵母中克隆出能调节细胞K+/Na+的基因HAL1导入吉林省主栽粳稻品种吉粳88和吉粳83中,经PCR、Southern杂交检测,获得246株转基因阳性植株。转基因水稻在p H值为11.0的Na OH和Na2CO3碱性胁迫下,吉粳83的转基因植株耐盐碱性为1级的有7株,3级的有29株;吉粳88的转基因植株耐盐碱性为1级的有6株,3级的有8株。