HAS2在胶质母细胞瘤中的表达及与预后、免疫细胞浸润的相关性研究

目的 探讨HAS2在胶质母细胞瘤中的表达及临床价值。方法 TCGA数据库中下载胶质母细胞瘤的转录组学数据,分析HAS2在胶质母细胞瘤中的表达及其与预后的关系,筛选胶质母细胞瘤中与HAS2的共表达基因并进行GO和KEGG富集分析,分析HAS2与免疫细胞浸润程度的相关性。纳入胶质母细胞瘤组织和癌旁组织,采用q-PCR和Western blot法检测并比较癌组织和癌旁组织中HAS2 mRNA和蛋白表达水平的差异。结果 HAS2在胶质母细胞瘤组织中的表达水平明显高于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.001);与TP53野生型相比,TP53突变型的胶质母细胞瘤患者HAS2的表达水平明显升高(P<0.05)。与低表达组相比,胶质母细胞瘤HAS2高表达组生存率明显降低(HR=1.6,P=0.013)。胶质母细胞瘤中与HAS2共表达基因富集的MF包括NADH脱氢酶活性,BP包括线粒体ATP合成,CC包括线粒体内膜,KEGG包括氧化磷酸化、PI3K-Akt信号通路等。HAS2与B细胞(r=0.428,P<0.001)、CD8~+T细胞(r=0.121,P<0.001)、CD4+T细胞(r=0.478,P<0.001)、巨噬细胞(r=0.454,P<0.001)、中性粒细胞(r=0.456,P<0.001)浸润程度均呈正相关性。与癌旁组织相比,胶质母细胞瘤组织中HAS2 mRNA和蛋白表达水平明显升高[(1.14±0.23)vs.(0.43±0.10),t=4.903,P=008]、[(0.86±0.11)vs.(0.06±0.01),t=12.545,P<0.001]。结论 HAS2与胶质母细胞瘤患者临床预后相关,可能作为胶质母细胞瘤治疗的一个潜在靶点。

叶酸拮抗剂甲氨喋呤导致斑马鱼心脏发育异常及BMP2b HAS2表达下调

目的该研究利用叶酸拮抗剂甲氨喋呤（MTX）构建叶酸生物学活性受抑制的斑马鱼模型后，观察叶酸生物学活性受抑后对斑马鱼心脏发育的干扰作用以及对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响。方法用不同浓度的MTX处理不同发育时段的斑马鱼胚胎，于48hpf（hours post fertilization）观察胚胎心脏发育情况并计数各组心脏发育异常个体的百分比及心率，评定MTX对斑马鱼心脏发育的影响程度。用1．5×10^-3M的MTX处理6～10hpf发育时段的斑马鱼胚胎作为MTX处理组。于24hpf及48hpf在显微镜下观察MTX处理组斑马鱼胚胎心脏发育情况。借助胚胎整体原位杂交和Real-time PCR的方法检测BMP2b和HAS2在正常对照组及MTX处理组胚胎的表达水平。结果胚胎早期发育阶段6～12hpf是斑马鱼胚胎对MTX的敏感时期。显微镜下观察结果显示MTX处理组斑马鱼心脏发育延迟，并有心脏形态发育明显异常。胚胎整体原位杂交结果显示MTX处理组斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2在心脏的表达于36hpf及48hpf下调。Real-time PCR结果显示MTX处理组斑马鱼BMP2b的相对表达量在12，24，36及48hpf减少，HAS2的相对表达量在24，36及48hpf减少。结论叶酸生物学活性受抑对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。

敲低lncRNA HAS2-AS1增加氧化应激促进CAL-27人口腔鳞癌细胞自噬性死亡

目的探究长链非编码RNA透明质酸合成酶2反义转录本1(lncRNA HAS2-AS1)基因对口腔鳞癌细胞自噬性死亡和氧化应激的影响。方法采用RNA干扰技术沉默CAL-27人口腔鳞癌细胞HAS2-AS1基因,应用实时荧光定量PCR检测HAS2-AS1的表达,Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3BⅠ(LC3BⅠ)、LC3BⅡ、自噬相关基因7(ATG7)、P62、胱天蛋白酶3(caspase-3)、裂解型caspase-3(c-caspase-3)、caspase-9、c-caspase-9、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(BAX)表达,免疫荧光细胞化学染色法检测细胞LC3B的表达,二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)负载检测细胞活性氧(ROS)的含量,流式细胞术检测细胞凋亡,试剂盒法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。结果敲低HAS2-AS1后,促进CAL-27细胞凋亡,提高细胞LC3BⅡ/LC3BⅠ、c-caspase-9/caspase-9、c-caspase-3/caspase-3、BAX/Bcl2比值以及ATG7、LC3B、MDA及ROS水平,降低P62和SOD水平。结论敲低HAS2-AS1增加细胞氧化应激促进口腔鳞癌细胞发生自噬性死亡。

斑马鱼HAS2基因的克隆、抗体制备及分析

HAS2是斑马鱼心脏发育的一个标志基因,为了利用斑马鱼动物模型进一步研究HAS2基因在心脏发育中的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了斑马鱼HAS2基因的片段.将所得的片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并将重组质粒(pGEX-4T-1-HAS2)转化大肠杆菌(E.coli)BL21,IPTG诱导表达GST-HAS2融合蛋白;通过尿素洗涤沉淀蛋白并切胶回收纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体活性.生物信息学分析结果表明:斑马鱼HAS2基因的开放阅读框含有1 658 bp,编码552个氨基酸;SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导表达的融合蛋白相对分子质量约为4.5×104;Western blotting分析表明,制备的抗体具有良好的特异性.

RNA干扰HAS2基因表达对多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞生物学特性及免疫因子的影响

目的:探讨透明质酸合成酶2(HAS2)基因在多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠表达及RNA干扰其表达对卵巢颗粒细胞活力、凋亡及免疫抑制因子TGF-β1和VEGF表达的影响。方法:建立DHEA致雌性SD大鼠PCOS模型,Western blot检测PCOS大鼠卵巢组织中HAS2的蛋白表达;培养原代PCOS大鼠卵巢颗粒细胞,将合成的靶向抑制HAS2表达的siRNA转染到细胞中,Western blot检测转染效果及转染后48 h各组细胞中免疫抑制因子TGF-β1、VEGF和NF-κB信号通路相关蛋白的表达。CCK8及流式细胞仪分别检测细胞活力和凋亡率。结果:HAS2在PCOS大鼠卵巢组织中高表达,转染si-HAS2的大鼠卵巢颗粒细胞中HAS2的表达显著低于NC组和对照组(P <0. 05);与NC组比较,si-HAS2组细胞活力显著降低,凋亡率增加,TGF-β1、VEGF及NF-κB信号通路p-NF-κB、p-IκBα和下游cyclin D1、survivin的蛋白表达均显著降低(P <0. 05)。结论:HAS2在PCOS大鼠卵巢组织中高表达,抑制大鼠卵巢颗粒细胞中HAS2表达可降低细胞活力,诱导细胞凋亡,下调免疫抑制因子TGF-β1、VEGF及NF-κB信号通路表达。

胃癌成纤维细胞中HAS2对胃癌细胞转移的影响

目的探讨胃癌成纤维细胞中透明质酸合成酶(HAS2)对胃癌细胞转移的影响。方法从手术切除的胃癌组织及癌旁正常组织中分别分离及培养胃成纤维细胞(CAFs)及正常成纤维细胞(NFs)。蛋白质免疫印迹(Western blot)及免疫荧光染色检测CAFs与NFs中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)及HAS2的表达。利用siRNA下调CAFs中HAS2的表达,Western blot及免疫荧光染色检测CAFs中HAS2的表达,细胞迁移(Transwell)及划痕闭合实验检测胃癌细胞SGC7901的侵袭及迁移能力,Western blot检测SGC7901细胞上皮-间质转化相关蛋白E-cadherin、vimentin及N-钙黏蛋白(N-cadherin)的表达。结果α-SMA与HAS2在CAFs中高表达,vimentin在CAFs与NFs中均表达,而E-cadherin在CAFs与NFs中不表达。与si-NC组相比,si-HAS2组CAFs中HAS2表达降低,SGC7901细胞的侵袭及迁移能力降低,SGC7901细胞中上皮-间质转化相关蛋白E-cadherin表达升高,而Vimentin及N-cadherin表达降低。结论下调胃癌CAFs中HAS2的表达,可抑制胃癌细胞的侵袭、迁移及上皮-间质转化。

补肾法对控制性超促排小鼠卵丘扩展分级及相关因子HAS2、TNFAIP6的影响

目的研究补肾调经Ⅱ号方、Ⅲ号方序贯给药对小鼠卵丘卵母细胞复合物(COCs)卵丘扩展分级情况及卵丘扩展相关因子透明质酸合成酶2(HAS2)、肿瘤坏死因子α刺激因子-6(TNFAIP6)表达的影响。方法将120小鼠随机分为正常组、模型组、补肾组。模型组、补肾组第1~9天腹腔注射醋酸丙氨瑞林(GnRHa),第9天同时注射血清促性腺激素(PMSG),48 h后注射绒毛膜促性腺激素(hCG),正常组注射等体积生理盐水;补肾组第1~9天灌胃补肾调经Ⅱ号方,第10~11天灌胃补肾调经Ⅲ号方,正常组与模型组灌胃等体积蒸馏水。注射生理盐水或hCG 6、9、12 h后在体式显微镜下取出卵丘卵母细胞复合物(COCs),观察卵丘扩展分级并计数,收集COCs,免疫荧光染色、实时荧光定量PCR检测卵丘扩展相关因子蛋白及mRNA的表达。结果与正常组相比,模型组的卵丘扩展分级情况及卵丘扩展相关因子的mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05);与正常组和模型组相比,补肾组的卵丘扩展分级呈现低级别扩展率降低、高级别扩展率升高的特点(P<0.05);注射生理盐水或hCG 6 h,正常组、模型组和补肾组3组间HAS2 mRNA的表达水平差异无统计学意义(P>0.05);注射生理盐水或hCG 9、12 h,与正常组和模型组相比,补肾组HAS2 mRNA的表达水平升高(P<0.05);注射生理盐水或hCG6、9、12 h,补肾组TNFAIP6 mRNA的表达水平升高(P<0.05)。结论补肾调经Ⅱ号方、Ⅲ号方序贯给药可促进小鼠COCs的卵丘扩展,推测其可能的机制与上调卵丘扩展相关因子HAS2、TNFAIP6 mRNA的表达有关。

黄芪-丹参药对通过下调miR-466b-5p改善高血压肾损害

目的:探讨黄芪-丹参药对通过调节微小核糖核酸-466b-5P(miR-466b-5p)改善高血压肾损害的机制。方法:基于微RNA(miRNA)测序寻找自发性高血压大鼠与Wistar-京都鼠(WKY)的差异基因,构建腺相关病毒转染小鼠,24只C57BL/6小鼠,随机选取12只尾静脉注射小鼠腺相关病毒miR-466b-5P(rAAV-miR-466b-5P)构建miR-466b-5p过表达组,余12只作为空白对照组注射腺相关病毒-9(AAV-9)空载体,转染6周后再各随机分为2组,每组6只,A组(黄芪-丹参+miR-466b-5P过表达组)和C组(黄芪-丹参+空白对照组)以黄芪配方颗粒:2.036 g/kg+丹参配方颗粒:0.255 g/kg灌胃;B组(miR-466b-5P过表达组)和D组(空白对照组)以相同体积生理盐水灌胃;灌胃28 d后观察各组小鼠尿β2-微球蛋白(β2-MG)、N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(NAG)、微量白蛋白(mALB),血清胱抑素C(Cys-C)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、C反应蛋白(CRP)水平和肾脏病理,进行实时荧光定量(RT-qPCR)与蛋白质印迹法(Western Blotting)寻找其靶基因。结果:1)基于前期miRNA测序选定了miR-466b-5p;2)与D组比较,B组小鼠尿β2-MG、NAG、mALB、血清Cys-C、AngⅡ、CRP均显著升高(P<0.01);与B组比较,A组小鼠血清Cys-C、CRP明显升高(P<0.05),尿β2-MG、NAG、mALB、血清AngⅡ无明显改变(P>0.05);3)与D组比较,B组小鼠出现明显肾小球硬化、小管纤维化,A组较B组有明显改善;4)与D组比较,B组小鼠透明质酸酶2(HAS2)明显下调,而经黄芪-丹参干预后有所回调。结论:miR-466b-5p的过表达会导致高血压肾损害的发生,黄芪-丹参药对通过靶向HAS2下调miR-466b-5p改善高血压肾损害。

透明质酸对体外培养的大骨节病和骨关节炎软骨细胞透明质酸合成酶2 mRNA表达的影响

目的对体外培养的人大骨节病和骨关节炎软骨细胞添加不同剂量透明质酸,观察干预前后软骨细胞透明质酸合成酶2(HAS2)mRNA的变化。方法选取2006年8月—2008年7月陕西地方病研究所明确诊断大骨节病,并实施膝关节游离体摘除术后取出游离体及关节软骨6例为大骨节病组;西安市红十字会医院明确诊断骨关节炎,并行全膝关节置换术后的膝关节软骨6例为骨关节炎组;另选择同时期由于意外车祸等原因截肢或身亡者的新鲜膝关节软骨6例为对照组。对3组软骨细胞采用不同剂量的透明质酸进行干预,分为0μg/ml(H0)、100μg/ml(H100)、500μg/ml(H500),通过RT-PCR法观察透明质酸对3组软骨细胞HAS2 mRNA表达的影响。结果干预前3组HAS2 mRNA表达比较,差异有统计学意义(P<0.05);其中骨关节炎组较对照组降低(P<0.05)。干预后3组不同剂量间HAS2 mRNA表达比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论退变的大骨节病和骨关节炎软骨细胞合成透明质酸能力下降;应用外源性透明质酸后,有增加软骨细胞自身透明质酸合成的趋势,为透明质酸关节腔注射治疗大骨节病及骨关节炎提供了理论基础。

子宫腺肌病内膜细胞中HAS-2和CD44的表达及雌激素对其影响

目的:探索子宫腺肌病(ADS)在位子宫内膜细胞中透明质酸合成酶(HAS)基因优势亚型和透明质酸受体CD44的表达及雌激素调节作用。方法:选择2017年10月—2018年9月在本院手术治疗的ADS患者21例为ADS组,19例无子宫内膜病变患者为对照组,qRT-PCR技术检测体外培养的子宫内膜细胞HAS各亚型(HAS1、HAS2、HAS3)和标准CD44 mRNA的表达及其对不同浓度雌激素作用的反应性。结果:ADS组子宫内膜细胞HAS2和CD44 mRNA的表达量(0.302±0.063、0.254±0.067)高于对照组(0.168±0.025、0.128±0.018)(P<0.0001),且两者在ADS组中表达呈正相关(r=0.797,P<0.0001);两组子宫内膜细胞HAS1和HAS3表达均无差异(P>0.05)。0.1、1.0、10.0 nmol/L 17β-雌二醇均能上调ADS组HAS2 mRNA表达量,与未用药0 nmol/L比较均有差异(P<0.05);对照组仅1.0 nmol/L 17β-雌二醇能显著上调HAS2 mRNA表达量,与未用药组比较有差异(P<0.05); 1.0、10.0 nmol/L 17β-雌二醇使ADS组CD44 mRNA表达量显著上调,与未用药组比较有差异(P<0.05);对照组仅10 nmol/L 17β-雌二醇可显著上调CD44 mRNA的表达量,与未用药组比较有差异(P<0.05)。结论:ADS子宫内膜细胞HAS2和CD44的表达异常增高且两者呈正相关,并受高浓度雌激素的正向调控。