猪捷申病毒HB株的分离与全基因序列分析

为分析河北省某规模化猪场猪捷申病毒(PTV)的遗传变异和进化关系,作者成功分离到PTV HB株,对其进行了毒力测定和动物回归试验,设计引物进行了全基因序列测定,并与国内外42株PTV全基因序列进行了同源性比较。结果表明猪捷申病毒HB株病毒滴度为10-6.4 TCID50.mL-1,健康仔猪接毒28d后均出现明显猪捷申病症状,该毒株全基因组序列长度为7 090bp。系统进化树分析表明,猪捷申病毒HB株(JQ664746)属于PTV-8型血清型,和国内分离的PTV-jilin/2003株(GQ293092)同源性最高,从而为进一步研究该毒株的遗传变异提供参考。

细菌HB-5对除草剂莠去津的酶促降解研究

研究了从高效降解细菌HB-5（Arthrobacter）中提取的降解酶的分离条件及酶对莠去津的降解性能．研究证明，对莠去津的降解主要是胞内酶在起作用．从高效降解菌HB-5中提取到的降解酶。在不含有莠去津的培养基中连续转接7次，会逐渐丧失对莠去津的降解代谢活性，由此判断该降解酶不是组成酶，而是诱导酶．以牛血清白蛋白为标准蛋白测得粗提酶中可溶性蛋白含量为0．65mg·mL^-1；在pH8．0～9．5之间，酶活力均能保持在最高酶活力的89％以上，该酶降解莠去津的最适pH为8．5；在25～45℃的温度范围内能保持较好的降解活性，最适温度为35℃；进一步研究发现，该酶具有较好的热稳定性和pH稳定性，暴露在温度30—40％，pH6．0—9．0的条件下2h仍能保持较高的酶活力；该酶与底物莠去津结合力强，对莠去津具有较好的降解效果，其米氏常数Km为0．7034mmol·L^-1，最大降解速率为0．1863μmol·mg^-1·min^-1．

莠去津降解菌HB-5的最佳产酶培养基及发酵条件

从农药厂废水中分离到一株降解莠去津的节杆菌(Arthrobacter sp.)HB-5,以从该菌中提取到的降解酶对莠去津的降解率为指标,进行最佳产酶培养基及发酵条件的优化研究,对其产酶量进行了评价.通过正交试验和均匀试验,对细菌HB-5的发酵培养基进行了优化研究.运用SAS软件进行结果分析,所获优化培养基配方为:蔗糖3.0g·L-1,莠去津0.38g·L-1,K2HPO40.5g·L-1,KH2PO41.2g·L-1,MgSO4.7H2O1.2g·L-1,NaCl0.1g·L-1,微量元素溶液3.8mL·L-1.得到菌株培养的最佳优化条件为:菌株发酵液培养时间为48h,接种量为2%,发酵液初始pH值为9,250mL三角瓶中装液量为80mL.经优化后,降解酶对莠去津的降解率(91.64%)比原培养基(40.67%)提高了125%.

肉鹅坦布苏病毒病免疫程序初探

为了制定合理、有效的肉鹅坦布苏病毒病免疫程序,选取鸭坦布苏病毒病灭活疫苗(HB株)和弱毒疫苗(FX2010-180P株)对7日龄和14日龄浙东白鹅进行不同疫苗组合(7日龄灭活苗+21日龄灭活苗组(A组)、7日龄弱毒疫苗组(B组)、7日龄弱毒疫苗+21日龄灭活苗组(C组)、14日龄灭活苗+28日龄灭活苗组(D组)、14日龄弱毒疫苗组(E组)、14日龄弱毒疫苗+28日龄灭活苗组(F组)、未免疫组(G组))的试验,用双抗体夹心ELISA法检测免疫后不同时间的抗体含量。结果表明:弱毒疫苗免疫组产生抗体较其他组快,但抗体含量持续时间较短;灭活疫苗+灭活疫苗(A组和D组)抗体含量从免疫完成后第24~36天抗体含量均高于弱毒疫苗(B组和E组)和弱毒疫苗+灭活疫苗(C组和F组),抗体持续时间更长。建议肉鹅可在14日龄用坦布苏病毒病灭活疫苗进行首免,14d后再接种一次,可获得较高的抗体含量。

伪狂犬病病毒HB-98株不同保存条件下病毒含量的比较

将同一批次的伪狂犬病病毒HB-98株病毒液与同一条件下冻干生产的成品分别在2℃～8℃和-20℃以下保存,间隔一定时间分别测定其病毒含量。发现无论在何种环境下保存,随着时间的推移,病毒含量趋于下降。但在一定时期内,病毒液在不同保存条件下病毒含量有明显区别,在2℃～8℃保存明显好于在-20℃以下保存;冻干后的成品在两种存放条件下短期存放则无明显区别。

牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因克隆及序列分析

【目的】对牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因进行克隆及序列分析,为阐明本病致病机理,更好的控制BVDV感染、流行提供理论依据。【方法】以牛病毒性腹泻病毒河北分离株(HB-DCZ)基因组RNA为模板,扩增BVDVHB-DCZ株基因组NS2-3片段cDNA。将PCR产物克隆后进行PCR及双酶切鉴定。克隆产物进行序列测定及分析。【结果】HB-DCZcDNA体外扩增获得特异性条带,大小约为665bp,表明该分离毒株基因组中无插入序列。PCR产物克隆,提取重组质粒,扩增获得特异性的DNA条带,长度约为665bp,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,获得两条DNA片段,长度分别为2600bp和702bp左右,与理论值相符。序列测定结果表明,克隆得到的NS2-3重要区扩增片段共665核苷酸,NS2-3重要区的蛋白质由208个氨基酸残基组成。HB-DCZ毒株NS2-3重要区核苷酸序列与已公开发表的BVDV其他毒株相比的同源性依次为184株99.1%,ZM195株97.4%,Osloss株92.3%,C_(24)V株77%,NADL株76.4%。HB-DCZ在NS2-3扩增区域中既没有外源序列的插入,也没有基因重组、重排或缺失,但存在某些核苷酸的替换。【结论】HB-DCZ与Osloss株、国内的184株、ZM195株遗传距离较近,与C_(24)V株、NADL株遗传距离较远。HB-DCZ株应为BVDVIb基因亚型。

传染性法氏囊病病毒超强毒株HB-bp人工感染雏鸡的病理学观察

5周龄非免疫健康鸡人工感染传染性法氏囊病病毒超强毒株河北分离株HB-bp,3d后出现明显的临床症状,3～4d内死亡率达80%。法氏囊、脾脏、盲肠扁桃体、胸腺及腺胃有病理组织学变化,各个免疫器官和组织中均含有病毒,法氏囊内病毒含量最高,其次是脾脏。而对照组未见任何异常变化。

传染性法氏囊病病毒HB株VP2蛋白的表达及免疫原性测定

为了研究传染性法氏囊病病毒河北分离株(HB株)VP2蛋白的免疫原性,对VP2基因进行了表达及免疫原性测定。将传染性法氏囊病病毒HB株VP2基因亚克隆到原核表达载体pET-32a-c(+)中并对其进行了诱导表达。SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,表达的重组蛋白约55ku,以包涵体形式存在。重组蛋白纯化后,免疫接种6周龄Balb/c小鼠,制备的血清ELISA效价在1∶6 400以上,说明所表达的HB株VP2蛋白免疫原性良好。

牛病毒性腹泻/黏膜病病毒河北分离株的生物学特性

【目的】了解牛病毒性腹泻病毒河北分离株HB株的特性,阐明牛病毒性腹泻/黏膜病致病机理,更好的控制BVDV感染、流行提供理论依据特进行此项试验;【方法】用理化学及生物学方法对BVDV河北分离毒株HB的特性进行检测,与BVDV准毒株OregonC24V株进行比较,分析了其理化性及生物学特性。电镜负染检查可见直径为40￣60nm有突起的圆形或近圆形的病毒颗粒,病毒在蔗糖中的浮密度为1.13￣1.14g/cm3。与牛病毒性腹泻-粘膜病病毒颗粒相似。毒力测定TCID50为10-4.5。理化学研究表明,该病毒对氯仿、乙醚、胰酶敏感;不耐酸、对碱具有较强的耐受性。牛病毒性腹泻/黏膜病病毒对56℃30min较敏感,56℃70min可使其完全灭活。血凝试验表明,该病毒对鸡、兔、猪和绵羊的红细胞均无血凝性;5-碘脱氧尿核苷(5,-IUDR)不能抑制病毒的增殖,核酸分型试验表明该病毒株基因组为RNA;病毒纯化后经SDS—PAGE电泳出现了5条主要结构蛋白带,与BVDV国际标准毒株OregonC24V株结果一致;【结论】河北分离株HB株为牛病毒性腹泻病毒。

猪伪狂犬病基因缺失疫苗的制备、安全性、免疫原性、保存期测定及区域试验

为了提供有效的伪狂犬病疫苗,用鸡胚成纤维细胞扩大培养了PrV HB-98突变株(TK-/gG-/LacZ+),研制了伪狂犬病基因缺失疫苗,并对该疫苗经肌肉接种、经口等免疫途径的最小免疫剂量进行了测定,同时也对4批疫苗的安全性、效力、免疫期和保存期进行了检测;同时将4批疫苗用于免疫23个猪场的母猪、新生仔猪和育肥猪进行区域试验。测定结果表明,疫苗经上述两种途径接种对不同阶段猪的最小免疫剂量均为105.0TCID50;10倍免疫剂量的疫苗对初生仔猪、15日龄仔猪和妊娠母猪是安全的,免疫猪能抵抗强毒的攻击;疫苗在4℃和-20℃下分别可保存6个月和12个月。对伪狂犬病毒抗体阴性的70日龄商品猪和种猪的免疫期为6个月。田间试验表明,4批猪伪狂犬病基因缺失疫苗安全有效,并可用于仔猪发病时的紧急接种。为猪伪狂犬病基因工程疫苗的制备与应用提供了有力的依据。

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株ORF6基因的克隆及原核表达

从河北沧州分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经4代盲传,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为HB-3(cz)株。根据GenBank公布的PRRSV JXA1株ORF6基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物(P1/P2),用RT-PCR方法扩增完整ORF6基因,将扩增产物连接到pGM-T载体并转化克隆菌,阳性重组质粒PGM-M进行序列测定与分析。后将克隆质粒PGM-M双酶切后连接原核表达载体pET-32a(+),在Rosseta-DE3中成功获得表达,经Western-blotting分析表明,表达蛋白与阳性血清发生特异性反应。

HB株E.tenella AMA-1基因的克隆及免疫调节型真核表达载体构建

为研究HB株柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)AMA-1基因的免疫原性,根据GenBank收录的AMA-1基因序列设计了1对引物,对HB株E.tenella的AMA-1基因进行克隆,应用生物信息学分析软件预测AMA-1基因的核苷酸及编码的蛋白质的结构和功能。连接pPIC9载体,并与细胞因子IL-2串联,构建真核表达载体pPIC9-IL-2-AMA-1,转化毕赤酵母细胞GS115,进行蛋白表达及纯化验证。结果显示,HB株E.tenella AMA-1基因全长为1617bp,编码535个氨基酸,具有跨膜区及信号肽。经酶切和测序鉴定表明,真核表达载体pPIC9-IL-2-AMA-1构建成功。毕赤酵母转化结果表明,成功将重组载体转化到毕赤酵母中,PCR鉴定得到2200,2100bp 2条带。Western blot检测结果表明AMA-1在毕赤酵母中得到了很好的表达。本试验结果为AMA-1基因的功能和核酸疫苗的研制提供依据。