人β防御素-2与前列腺癌特异性膜抗原嵌合蛋白真核表达质粒构建及其诱导的小鼠特异性免疫应答

探索人β防御素2 (h BD- 2 )和前列腺特异性膜抗原(PSMA)共表达重组核酸疫苗针对前列腺癌的免疫治疗。研究以pc DNA3.1为载体,构建重组质粒pc DNA3.1/PSMA和pc DNA3.1/h BD- 2 - PSMA,通过RT- PCR和免疫组化检测其表达。免疫小鼠后,进行血清中抗体检测,CD4 +、CD8+ T淋巴细胞数目测定及CTL 特异性杀伤作用检测。结果显示构建的质粒转染COS- 7细胞后能表达目的基因,免疫小鼠后能在体内持久表达,可以诱导产生特异性抗体,能有效的刺激T细胞增生,诱导特异性CTL 反应。当以h BD- 2作为免疫佐剂时,CTL 活性更强。本研究成功的构建了含PSMA的表达质粒,免疫小鼠可以诱导出有效的体液和细胞免疫。

人β-防御素-2在肺癌组织中的表达水平及其临床意义

目的探讨人β-防御素-2(hBD-2)在肺癌组织中的表达及其临床意义。方法收集32例不同类型肺癌的标本,每份标本取癌组织及癌旁正常组织。采用免疫组化及Western blot检测其hBD-2的表达,并作半定量分析。结果hBD-2在癌组织中的表达高于正常组织,其表达在不同的临床分期之间存在显著性差异,而在不同病理类型的癌症组织中的表达差异无统计学意义。同样,免疫组化显示hBD-2在肺癌组织表达较正常组织高。结论人β-防御素-2可能参与肺癌的发病机制,其表达水平可能与肺癌病情进展有关。

白介素-1与β2防御素对胎膜早破合并羊膜腔感染预测的意义

目的通过测定外周血白介素-1(IL-1)及β2防御素(HBD-2)水平,探讨他们在胎膜早破中的作用,分析其与羊膜腔感染的相关性,为临床的诊断与治疗提供新的思路。方法 42例胎膜早破患者分别测定外周血IL-1及HBD-2水平,与20例对照组进行比较,根据胎膜病理诊断结果,实验组进一步分出组织学绒毛膜炎组(HCA)和非组织学绒毛膜炎组(非HCA组),比较两组间HBD-2及IL-1水平。结果 42名胎膜早破患者中,病理证实胎膜早破无感染者(非HCA)24例,感染者(HCA)18例。HCA组IL-1水平与非HCA组比较,差异显著,P<0.01;HCA组IL-1水平与对照组比较,差异显著,P<0.01;非HCA组的IL-1水平与对照组比较,无显著性差异,P>0.05。HCA组HBD水平与非HCA组比较,差异显著,P<0.05;HCA组HBD水平与对照组比较,差异显著,P<0.01;非HCA组的HBD水平与对照组比较,无显著性差异,P>0.05。从均数直观图观察到,随着胎膜早破的出现,感染的发生,IL-1、HBD水平均有升高的趋势。通过ROC曲线观察,当IL-1以80.22pg/ml为分界点时,诊断HCA的敏感性为0.78,特异性为0.75;当HBD以474.79ng/L为分界点时,诊断HCA的敏感性为0.67,特异性为0.79。结论胎膜早破患者外周血IL-1、HBD-2水平有预测和诊断HCA的可能,其升高在HCA患者中有统计学意义,为临床HCA的诊断提供新的手段。

溃疡性结肠炎患者结肠黏膜HBD-2和NF-κB及IL-8的表达

目的研究β-防御素2(HBD-2)、核因子-κB(NF-κB)、白细胞介素-8(IL-8)在溃疡性结肠炎(UC)患者结肠黏膜中的表达,探讨HBD-2、NF-κB和IL-8在UC发病中的作用和相互关系。方法收集30例UC患者和10例正常结肠黏膜组织,用免疫组织化学法检测HBD-2、NF-κB和IL-8蛋白表达。结果免疫组织化学分析显示,UC组HBD-2、NF-κB和IL-8表达阳性率和表达强度明显高于正常结肠黏膜组(P<0.01);UC轻中重度三组结肠黏膜中HBD-2、NF-κB和IL-8表达阳性率和表达强度比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论HBD-2、NF-κB和IL-8水平在UC结肠黏膜组织中明显升高,但与UC病情轻重关系不密切。

寻常型银屑病患者皮损中HBD-2和TNF-α的表达及意义

目的:探讨寻常型银屑病皮损中人β防御素2(HBD-2)与肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达及其相关性。方法:采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测45例寻常型银屑病患者的皮损组织、非皮损组织以及15例正常人皮肤组织中HBD-2 mRNA及TNF-αmRNA的表达。结果:寻常型银屑病皮损组HBD-2 mRNA和TNF-αmRNA表达显著高于非皮损组和正常对照组。在皮损组HBD-2 mRNA与TNF-αmRNA的表达呈正相关,且二者的表达均与患者PASI评分成正相关。结论:HBD-2和TNF-α在寻常型银屑病发病中可能起相互协同的作用,加重了银屑病的炎症反应。

人抗菌肽HBD-2的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

制备人β-防御素2(HBD-2)多克隆抗体,以用于HBD-2蛋白水平表达的检测。提取人肠腺上皮细胞株Caco-2总RNA,设计引物,应用RT-PCR从其总RNA中扩增HBD-2成熟肽cDNA片段,以pGEX-1λT为载体,构建原核表达质粒pGEX-1λT-HBD-2。大肠杆菌裂解物经亲合层析纯化后获得分子量约30kDa的融合蛋白,将此融合蛋白免疫新西兰兔,并用正辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化抗血清,ELISA法显示抗血清对HBD-2的效价为1∶12800,Western印迹显示抗血清可识别HBD-2。本实验结果证明应用重组融合小肽代替白蛋白或甲状腺-肽偶联免疫可获得其高效价的识别HBD-2的多克隆抗体,为今后从蛋白质水平研究HBD-2基因的诱导表达,包括组织分布和基因表达调控等研究打下了基础。

溃疡性结肠炎和肠易激综合征结肠黏膜HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23的表达

目的探讨溃疡性结肠炎和肠易激综合征患者结肠黏膜HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23的表达及临床意义。方法选择溃疡性结肠炎(UC组)和腹泻型肠易激综合征(腹泻型IBS组)各40例,另选择正常对照组20例,取结肠黏膜标本采用免疫组化SP法进行HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23染色。结果 UC组HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23阳性率及表达均显著高于腹泻型IBS组和对照组(P<0.05),UC组不同病情程度之间HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23阳性率差异有统计学意义(P<0.05),HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23表达均与病情程度呈正相关(P<0.05),而腹泻型IBSIL-6和IL-23阳性率及表达与轻度UC差异无统计学意义(P>0.05)。UC患者黏膜HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23表达之间均呈正相关(P<0.05)。结论 HBD-2、NF-κB、IL-6和IL-23在UC结肠黏膜中高表达,参与UC的发生发展过程,而IL-6和IL-23在IBS结肠黏膜中高表达,IBS黏膜炎症改变与轻度UC相似,IBS与UC之间存在相关性。

NOD2在舌鳞癌中的表达特征及功能变化

目的:检测NOD2在舌鳞癌中的表达特征及功能变化。方法:采用免疫组织化学、RT-qPCR检测人舌鳞癌和正常舌黏膜组织中NOD2的表达;采用免疫荧光、RT-qPCR检测NOD2活化对人舌鳞癌细胞株Tca8113、正常舌黏膜上皮细胞分泌hBD-2的影响。应用SPSS 13.0软件包对各组mRNA的表达进行t检验及多个样本均数的方差分析。结果:①NOD2蛋白表达于细胞质,舌鳞癌组织中NOD2的蛋白表达率为64.0%(16/25),显著低于正常舌黏膜组织的表达率84.0%(21/25,P<0.05)。舌鳞癌组织NOD2 mRNA表达量为正常舌黏膜组织的(0.521±0.080)倍(P<0.05)。②hBD-2表达于细胞质,Tca8113细胞中hBD-2为低表达和阴性表达,MDP处理6 h、12 h后,Tca8113细胞中hBD-2mRNA的表达量较处理前显著上调(1.770±1.202)、(68.277±48.946)倍(P<0.05)。结论:舌鳞癌组织中NOD2 mRNA和蛋白表达显著低于正常舌黏膜组织,NOD2激动剂MDP能上调Tca8113细胞中hBD-2 mRNA和蛋白的表达。推测在舌黏膜中NOD2能调节hBD-2表达,可能影响舌鳞癌的免疫功能,与舌鳞癌进展相关。

人β防御素2和白介素1β在中耳黏膜上皮的表达

目的研究人β-防御素-2(HBD-2)、白介素-1β(IL-1β)在中耳黏膜上皮中的表达情况,探讨其在中耳炎病理发展过程中的作用。方法应用免疫组织化学方法检测慢性中耳炎中耳黏膜上皮及正常外耳道皮肤中HBD-2、IL-1β的表达。结果 HBD-2和IL-1β在中耳炎中耳黏膜的表达较正常外耳道皮肤中上调,有显著性差异(P<0.05);HBD-2和IL-1β在中耳黏膜中的表达有一定的相关性(r=0.9117,P<0.05)。结论中耳炎症状态下,中耳黏膜上皮HBD-2、IL-1β表达上调并可能相互影响,在中耳炎病理发展中发挥一定的作用。

脂质相关膜蛋白体外诱导hBD-2基因表达的研究

目的探讨解脲支原体(UU)的L AMPs对β-防御素表达分泌量与作用时间的研究。方法应用LAMPs体外诱导绒毛膜及胎盘组织hBD-2基因表达,RT-PCR检测hBD-2 mRMA表达。结果不同浓度的LAMPs均能明显诱导绒毛膜及胎盘组织产生hBD-2,相同浓度的LAMPS刺激绒毛膜及胎盘组织12 h,24 h绒毛膜及胎盘组织的HBD-2 mRNA表达量不同。结论绒毛膜及胎盘组织HBD-2 mRNA表达与LAMPs呈明显的剂量依赖性;24 h内绒毛膜及胎盘组织的HBD-2 mRNA表达呈现出时间依赖性。

白介素-22诱导肺泡上皮2型人β防御素表达的初步研究

目的:初步探讨对于直接或间接引起的肺内感染,炎症反应产生的白介素(IL)-22能否刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞,并且诱导其生成、释放2型人β防御素(humanβ-defensin-2,HBD-2)发挥抗感染作用。方法:流式细胞术检测肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞膜表面IL-22R表达水平。重组人IL-22(20 ng/ml)刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞,RT-PCR检测不同时间(0、2、4、8、16、24 h)HBD-2表达情况。不同浓度的重组人IL-22(0、4、20、100、500 ng/ml)刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞,RT-PCR检测HBD-2表达情况。结果:肺泡Ⅱ型上皮细胞膜表面IL-22R表达呈强阳性,阳性率达(99.90±0.13)%。比较6个时间点HBD-2表达差异,发现HBD-2表达具有时间依赖性。比较不同浓度IL-22处理下HBD-2表达差异,IL-22 100 ng/ml为最佳干预浓度,且HBD-2表达与IL-22浓度具有依赖关系。结论:IL-22能显著诱导肺泡上皮细胞生成并释放HBD-2,且具有时间和剂量依赖性。

创伤后感染致多器官功能障碍综合征患者血清β-hBD-2、OPN、pro-ADM和NPt水平的变化

目的:探讨多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)患者的炎症感染病理过程中炎性介质水平的变化。方法:血清人类β防御素-2(humanβ-defensin-2,β-hBD-2)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和新蝶呤(neopterin,NPt)采用酶联免疫分析法(ELISA)测定,肾上腺髓质素前体(pro-adrenomedullin,pro-ADM)检测采用化学免疫发光法。结果:四项血清标志物测定结果分别显示,对照组和确诊时组β-hBD-2、OPN、pro-ADM、NPt四种血清炎症介质标志水平均显著高于正常人组(P<0.05,P<0.01),出院前组β-hBD-2、OPN水平显著高于正常人组,另两项指标均与正常人组比较无显著性差异(P均>0.05);同时确诊时组与对照组比较β-hBD-2、OPN、pro-ADM三项指标水平也显著升高(P<0.05,P<0.01),NPt水平患者组呈略高,但无统计学意义(P>0.05);出院前组β-hBD-2、OPN、pro-ADM、NPt四种血清炎症介质标志水平均显著低于确诊时组(P<0.05,P<0.01)。结论:MODS患者的炎症感染病理过程中炎性介质水平显著升高,其测定对于临床抗感染治疗提供重要价值。

人β防御素-2基因的克隆及原核表达载体的构建

目的构建人β-防御素2的融合性原核表达载体,为今后基因工程手段表达纯化及生产人β-防御素-2奠定基础。方法体外基因合成人β-防御素2(HBD-2)的基因片段,并克隆入pMD18T中间载体中,经酶切鉴定后再克隆入pET32a原核表达载体中,与载体中所固有的TrX-A形成融合基因。结果构建的融合性原核表达载体经酶切鉴定无突变发生。结论成功地构建了pET-32a-(HBD-2)。

细菌性阴道病hBD-2 mRNA表达的变化及微生态制剂、中药对其影响

目的研究细菌性阴道病(BV)患者hBD-2 mRNA表达量的变化和微生态制剂、中药提取物对其的影响。方法将BV患者随机分为4组,即健康对照组(n=10)、BV组(n=10)、微生态制剂治疗组(n=8)和中药治疗组(n=7)。采用RT-PCR半定量法,检测阴道组织hBD-2 mRNA的水平。结果与健康对照组相比,BV组、微生态制剂治疗组和中药提取物治疗组hBD-2 mRNA的水平明显升高(P<0.05);微生态制剂治疗组和中药治疗组hBD-2 mRNA的水平平均分别较BV组增高(P<0.05)。结论微生态制剂和中药对BV患者治疗可以使hBD-2 mRNA表达水平上调,提示其在维系正常妇女生殖道内环境稳定、宿主天然抗感染机制中起着重要的作用。

人β-防御素-2基因5′-端转录调控序列分析

目的 :对在LPS、TNF α刺激下 ,人 β 防御素 2基因 5′ 端转录调控机制进行初步分析。 方法 :将HBD 2基因 5′ 端上游序列连接入无启动子的pEGFP 1质粒 ,构建了系列 5′端缺失的 pEGFP 1 /HBD 2报告质粒。pEGFP 1 /HBD 2质粒转染细胞后给予LPS、TNF α刺激 ,用RT PCR检测 pEGFP的mRNA浓度。 结果 :显示HBD 2基因上游 2 41段有较强的启动子活性 ;LPS、TNF α刺激后 ,即使上游序列缩短至 2 41位点时 ,报告基因 pEGFP的mRNA表达量仍明显增高。说明HBD 2基因上游 2 41区域含有LPS、TNF α刺激后激活的转录因子作用位点。计算机分析表明 2 3 2 / 2 2 2区域有一同源性极高的NF kB结合元件 ,提示NF kB结合元件可能调控HBD

口腔上皮细胞感染白假丝酵母菌后HBD-2蛋白的表达

目的检测人β防御素2(Human beta defensin-2,HBD-2)在口腔上皮细胞中的表达以及白假丝酵母菌对其表达的影响。方法分别以孢子相、菌丝相以及灭活的白假丝酵母菌与KB细胞共同培养6、12、24h后,采用ELISA技术检测各组KB细胞培养液中HBD-2蛋白的表达情况,与对照组进行比较。结果 KB细胞有HBD-2蛋白的基础表达,感染6h后,各实验组与对照组之间表达差异无统计学意义(P>0.05);感染12h后,孢子组(93.974±6.426)、菌丝组(72.287±2.839)显著高于对照组(37.380±5.663),P<0.01;感染24h后,各实验组表达均高于对照组(P<0.05),但和12h时的表达相比,孢子组(80.851±7.860)、菌丝组(63.932±8.070)出现了下降趋势(P<0.05)。结论 HBD-2在口腔上皮细胞中有基础表达,白假丝酵母菌能诱导其表达上调;白假丝酵母菌对HBD-2的诱导表达只发生在感染的特定时期内,当菌丝进一步侵袭后,HBD-2的表达会逐渐减弱。

防御素HBD-2在口腔白斑病损中表达的研究

目的:探讨口腔白斑(OLK)患者病损中的防御素HBD-2的表达,以分析HBD-2在OLK发病机制与上皮抗感染免疫中的作用。方法:采用免疫组织化学技术(IHC)检测8例OLK病损组织,6例对照组织中HBD-2多肽的表达,并进行分析。结果:HBD-2在所有样本中均出现了阳性胞浆染色,健康口腔黏膜组中HBD-2蛋白为弱阳性染色,与呈强阳性染色的OLK组差异有统计学意义(P<0.05)。结论:健康口腔黏膜组织也有少量HBD-2表达,提示其作为机体先天性免疫的组成部分,在维持口腔黏膜健康上具有一定作用。在OLK的病理过程中HBD-2上调表达而参与了OLK的发病过程,HBD-2有可能与癌前病变有相关性。

人β-防御素-2植物表达载体的构建

用重组基因 (hBD 2 )替换双元载体 pCAMBIA130 4中的GUS GFP基因 ,构建成植物表达载体pCAMBIA130 4 hBD2 ,并经过了酶切、PCR和序列分析验证 .该载体的构建可为培育转基因抗病植物和利用生物反应器生产防御素奠定基础 .

人hBD2高表达易分离逆转录表达载体构建

目的 通过现代分子生物学技术 ,构建人pLNCX2 CEA信号肽 EK激酶 hBD2抗菌肽逆转录表达载体 ,为下一步在真核细胞中高表达hBD2奠定基础。方法 PCR法将CEA信号肽、EK激酶识别位点序列、上下游酶切位点及保护性碱基克隆在一个片段上 ,酶切后 ,T4DNA连接酶将此片段定向连接在含hBD2基因片段的 pBluescriptSK质粒上 ,经过反复构建 ,最终完成pLNCX2 CEA EK hBD2 (成熟肽 )融合基因及其载体 ,并采用逆转录病毒法将融合基因整合到宿主细胞中。 结果 构建到逆转录表达载体pLNCX2上的目的基因双酶切后琼脂糖电泳及测序正确 ,RT PCR检测出宿主细胞融合基因表达。结论 成功构建pLNCX2 CEA EK hBD2逆转录表达载体 ,并整合入宿主细胞中表达。

支原体性宫颈炎粘膜HBD-2mRNA的表达

目的探讨支原体感染的非淋菌性宫颈炎患者人β防御素-2(hBD-2)的表达。方法采用RT-PCR法对10例患者皮损hBD-2mRNA检测,并以10例正常组织做对照。结果正常人和患者均可检测到hBD-2mRNA表达,但支原体感染的非淋菌性宫颈炎患者表达比明显增多。结论hBD-2参与了支原体性宫颈炎发病过程。