松辽黑猪HBEGF基因多态性及其与繁殖性状的关联分析

【目的】分析肝素结合型表皮生长因子样生长因子(heparin-binding EGF-like growth factor,HBEGF)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点在松辽黑猪中的遗传多样性及其与繁殖性状的相关性。【方法】选择90头健康经产松辽黑猪母猪,采用Sanger直接测序法检测HBEGF基因的SNP位点,利用SPSS 26.0软件分析HBEGF基因SNP位点与松辽黑猪繁殖性状(总产仔数、产活仔数、初生重、3周龄重、断奶重、断奶仔猪数和乳头数)的相关性。【结果】在松辽黑猪HBEGF基因第5外显子及第2、3、4、5内含子上共发现22个SNPs位点,其中有8个SNPs位点与繁殖性状存在显著关联。g.142114384 A>G和g.142104389_142104388ins A>G位点存在AA、AG和GG 3种基因型;g.142114375 C>A位点存在CC、CA和AA 3种基因型;g.142111433 C>T位点存在CC和CT 2种基因型;g.142106003 G>A和g.142105707_142105706ins G>A位点存在GG、GA和AA 3种基因型;g.142105965 C>G位点存在CC、CG和GG 3种基因型;g.142105878_142105877ins C>T位点存在CC、CT和TT 3种基因型。卡方适合性检验结果显示,g.142114375 C>A、g.142111433 C>T和g.142104389_142104388ins A>G位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。g.142114384 A>G、g.142114375 C>A、g.142106003 G>A、g.142105878_142105877ins C>T和g.142104389_142104388ins A>G位点均为中度多态(0.25<PIC<0.5),g.142111433 C>T、g.142105965 C>G和g.142105707_142105706ins G>A位点均为低度多态(PIC<0.25)。关联分析结果表明,g.142114384 A>G位点AA基因型个体总产仔数、产活仔数、断奶仔猪数均显著高于GG基因型,GG基因型个体初生重显著高于AG基因型,GG基因型个体乳头数显著高于AA、AG基因型(P<0.05);g.142114375 C>A位点AA基因型个体总产仔数、产活仔数均显著高于CC基因型(P<0.05),AA基因型个体断奶仔猪数显著高于CC、CA基因型(P<0.05);g.142111433 C>T位点CC基因型个体乳头数显著高于CT基因型(P<0.05);g.142106003 G>A位点GG基因型个体乳头数显著高于AA基因型(P<0.05);g.142105965 C>G位点CC、GG基因型个体总产仔数、产活仔数和断奶仔猪数均显著高于CG基因型(P<0.05);g.142105878_142105877ins C>T位点CC、TT基因型个体断奶仔猪数显著高于CT基因型,TT基因型个体乳头数显著高于CC基因型(P<0.05);g.142105707_142105706ins G>A位点AA基因型个体3周龄重和断奶重均显著高于GG基因型(P<0.05);g.142104389_142104388ins A>G位点AG基因型个体总产仔数、产活仔数均显著高于AA基因型(P<0.05)。【结论】HBEGF基因中存在8个SNPs位点,与松辽黑猪总产仔数、产活仔数、初生重、3周龄重、断奶重、断奶仔猪数和乳头数均有显著关联。

构建Alb启动子调控HBEGF肝特异性表达的慢病毒载体及其功能验证

目的构建肝特异性Alb(白蛋白)启动子调控HBEGF(Heparinbinding-epidermal growth factor)表达的慢病毒载体p LV-ATTG。方法首先以p Alb-Cre-GH/BS为模板,PCR扩增目的基因Alb-enhancer/promoter,In-Fusion克隆至Not I酶切的p TRECK6-GFP中,获得p AlbTRECK6(TRECK:toxin receptor-mediated conditional cell knockout);接着以p Alb-TRECK6为模板,PCR扩增Alb-TRECK6,In-Fusion克隆至Xba I/Bam H I酶切的p CD823A-1载体(该载体已卸去EF-1α启动子)中,获得最终的慢病毒载体p LV-ATTG,所构建的质粒均经测序和酶切鉴定。然后按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装。包装成功的慢病毒LV-ATTG感染肝癌细胞株BEL-7402细胞,倒置荧光显微镜检测cop GFP表达,并收集细胞提取总RNA,以检测HBEGF表达。结果酶切鉴定和测序证实成功构建了慢病毒载体p LV-ATTG;LV-ATTG感染BEL-7402细胞后,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光,同时q RT-PCR检测结果显示HBEGF转基因能够正常表达。结论成功构建Alb启动子调控HBEGF表达的慢病毒表达载体,为相关后续研究奠定了坚实基础。