甘蔗条纹花叶病毒HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg基因酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测

为探索甘蔗条纹花叶病毒与甘蔗的互作机制,利用酵母双杂交技术筛选与SCSMV互作的甘蔗因子基因,利用PCR技术克隆了SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg的编码区,构建到酵母双杂交诱饵载体p GBKT7上,获得了p GBKT7-HC-Pro、p GBKT7-P3N-PIPO、p GBKT7-CP和p GBKT7-VPg 4个诱饵载体。结果显示,将重组质粒转化酵母Y2HGold酵母菌株后,酵母菌株在SD/-Trp平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性;在SD/-Trp/X-α-gal平板上长出白色菌落未变蓝,在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/X-α-gal/Ab A平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对MEL1、ADE2、HIS3和AUR1-C报告基因无自激活作用。构建的诱饵表达载体可以作为诱饵用于文库筛选,为探索SCSMV侵染机制和发病机理奠定了基础。

马铃薯Y病毒HC-Pro中心区域在病毒协生作用中的主导地位

利用PCR方法获得了马铃薯病毒中国株系 (PVY C)HC Pro基因的 5个缺失突变体 ,构建了相应的植物表达载体。通过土壤农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)介导法转化了烟草品种K32 6 (Nicotinatabacumcv.K32 6 )。PCR和Southernblot分析证明了HC Pro基因及其缺失突变体已整合到烟草基因组中 ,Westernblot表明它们在转基因烟草中得到了表达。侵染性试验发现HC Pro中心区域介导转基因烟草中PVY C和黄瓜花叶病毒 (CMV)、PVY C和马铃薯X病毒 (PVX)之间的协生作用 ,从而明确了PVY CHC

玉米矮花叶病毒HC-Pro在蚜虫传毒过程中的作用机制

本文用亲合印迹法测定了玉米矮花叶病毒 ( MDMV)与 MDMV HC- Pro,及二者与蚜虫蛋白之间的互作。结果表明 ,MDMV HC- Pro可以与 MDMV结合 ,也可以直接与 MDMV的介体——麦二叉蚜 ( Schizaphis graminum)中分子量约为 56k D的可溶性蛋白结合 ,而 MDMV不能与麦二叉蚜的可溶性蛋白直接结合。无论是 MDMV HC- Pro,还是 MDMV,都不能结合非介体灰飞虱 ( Laodelphaxstriatellus)的可溶性蛋白。酶联板模型的结果与此一致。上述结果说明 ,病毒不能直接与蚜虫口针中的病毒附着位点 ( VAS)结合 ;HC- Pro一端连接病毒 ,一端连接 VAS,在蚜虫传播 MDMV的过程中起桥梁作用。这是关于病毒 HC-

中国大豆花叶病毒HC-Pro基因的克隆与序列分析

通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),克隆了我国6个大豆花叶病毒(SMV)分离物的HC-Pro基因全长cDNA,并测定了其全序列,探索其与病毒致病性和交叉保护作用的关系。结果表明:HC-Pro基因全长为1371nt,编码的HC-Pro蛋白为457个氨基酸,其中包含与病毒移动有关的CCC基序、与蚜传相关的PTK基序等功能结构域。6个SMV分离物的HC-Pro基因核苷酸序列同源性为89.2%～99.9%,由此推导的氨基酸序列同源性为95.4%～99.8%,其中SMV分离物TS216和4434仅有1个碱基差异。将序列信息与6个SMV分离物在10个鉴别寄主上的症状反应以及分离物间的交叉保护作用进行综合分析发现,HC-Pro基因同源性高的SMV分离物在鉴别寄主上的致病性反应没有明显的相似性,而HC-Pro基因同源性高、亲缘关系近的部分SMV分离物之间交叉保护作用明显。结果证明6个SMV分离物的HC-Pro基因高度同源,同源性高低与其在鉴别寄主上的致病性反应没有明显联系,但同源性高、亲缘关系近的分离物间交叉保护作用可能较强。

HC-Pro基因片段介导的高抗TuMV

芜菁花叶病毒(turnip mosaic viruses,TuMV)是侵染重要经济作物的主要病毒之一,寄主范围十分广泛,尤其是对十字花科作物的危害最为严重。为了获得对TuMV持久稳定的高度抗性,本研究以TuMV HC-Pro基因的453 bp保守序列为靶标,构建了植物表达RNAi载体pBBBTu-HC-Pro,并转化了TuMV的天然宿主拟南芥。对转基因拟南芥用北京地区流行的TuMV强致病株BJ-C4进行了抗病接种鉴定。鉴定的13个单拷贝转基因株系中有4个对TuMV的BJ-C4株表现出高度抗性,抗性比对照提高约80%以上,且抗性可以稳定遗传。经半定量和荧光定量PCR方法检测,在高抗转基因植株体内几乎检测不到病毒的累积,抗病效果明显。该载体在利用基因工程抗TuMV育种中具有广阔的应用前景。

大豆花叶病毒HC-Pro基因保守序列克隆及其RNAi载体的构建

大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)病是全球最主要的大豆病害之一,严重危害大豆的产量和品质。RNA干扰(RNA interference,RNAi)能够在mRNA水平特异性沉默同源靶基因,为抗病毒作物的培育提供了新的途径。本研究对国内外11个不同SMV流行株系的HC-Pro基因进行了核苷酸序列比对,并以SC3株系的cDNA为模板克隆出高度保守的268 bp的基因片段,进而利用GATEWAY技术构建了适合农杆菌介导大豆转化的RNAi表达载体pB7GWIWG2(II)-HC-Proi。并对BP反应和LR反应的纯化产物进行了测序鉴定,测得序列在NCBI上进行比对,匹配度为100%;以35S启动子和终止子设计引物,扩增得到464和478 bp两个片段,说明HC-Proi基因与pB7GWIWG2(II)重组形成反向重复结构,载体构建成功。结果为利用RNA干扰技术改良大豆对大豆花叶病毒的抗性奠定了基础。

甘蔗线条花叶病毒HC-Pro基因的分子变异分析

为了解析甘蔗线条花叶病毒Sugarcane streak mosaic virus(SCSMV)不同分离物HC-Pro基因的分子变异规律,本研究利用RT-PCR法扩增获得SCSMV HC-Pro基因的序列,通过生物信息学分析,分别从重组、系统发生、选择压力等方面研究SCSMV HC-Pro基因的分子变异特征。共测定了44条SCSMV HC-Pro基因序列,相似性最低值为70%;HC-Pro基因重组频率较低,仅发现3个重组位点,其中一个系首次报道;与先前报道相比,部分新测定云南蔗区的SCSMV分离物在HC-Pro基因上形成一个新组-第Ⅲ组;HC-Pro基因处于很强的负选择压力作用,未发现正向选择作用位点。本研究结果进一步证明SCSMV HC-Pro基因具有高度的遗传多样性。

芜菁花叶病毒温州分离物HC-Pro基因序列分析

从浙江温州盘菜上获得芜菁花叶病毒温州分离物（TuMV-WZ）,病毒提纯后,经电镜观察,可发现大量长约700nm的线形粒子。利用免疫捕捉RT-PCR,通过特异性引物对TuMV-WZ的HC-Pro基因进行PCR扩增,经电泳可见1.5kb的特异条带。PCR扩增产物经过纯化后进行序列测定,序列长度为1449个核苷酸,编码482个氨基酸。其核苷酸序列与已报道的TuMV的其他分离物（Canada,UKl和Japanese）同源率分别为83.9％、96.5％和94.0％,氨基酸同源率分别为97.3％、98.8％和99.0％。

甘蔗转HC-Pro基因的研究

通过基因枪(PDS-1000He)轰击法将构建好的多功能蛋白HC-Pro的植物表达载体pHCFL与带PMI筛选标记基因的pZMLR14植物表达载体共转化导入易感花叶病甘蔗品种福农95-1702的胚性愈伤组织中,转化的愈伤经甘露糖筛选后获得抗性转化甘蔗幼苗。经PCR检测、氯酚红显色、RT-PCR检测和DNA点杂交分析获得转HC-Pro的转基因植株,转化率为0.8%(HC-Pro基因)、1.7%(PMI基因)和0.4%(HC-Pro基因+PMI基因)。花叶病毒接种实验结果显示,未转基因植株的发病率为75%,而转基因植株均系统性发病,推测由于HC-Pro的大量表达抑制了甘蔗体内自身的RNA沉默机制而使病情加重。其它农艺性状调查结果显示,转基因与未转基因植株之间不存在显著差异,表明转HC-Pro和PMI基因对甘蔗的生长或其他农艺性状没有负面影响。

西瓜花叶病毒HC-Pro基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR方法获得了西瓜花叶病毒（WMV）陕西分离物HC-Pro基因，大小为1371bp．将HC—Pro基因克隆到pMD18-T SimpleVector，测序分析发现与其它国家HC—Pro核苷酸同源性为90．7％～94．8％．将HC—Pro基因定向插入EcoRⅠ／SalⅠ切开的pET30a中，构建了原核表达载体pET30-WHC，转化大肠杆菌BL21．经IPTG诱导2～8h后，成功表达了分子量约为57kD的HC-Pro蛋白．通过不同时间诱导发现，加入IPTG2h后蛋白开始表达，继续诱导到8h后表达量变化不大．以诱导的蛋白为抗原免疫家兔，制备了HC-Pro蛋白的抗血清，ELISA法测其效价为1／6400，Westernblot分析能与HC-Pro发生血清学反应．

马铃薯Y病毒N株HC-pro基因的序列分析与表达

马铃薯Ｙ病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯Ｙ病毒属(Potyvirus)的典型成员,是烟草、马铃薯和辣椒等茄科作物病毒病的主要病原之一,分布于世界各地.近年烟草上的 PVY在全国范围内特别是陕西、黄淮和东北烟区流行呈上升趋势,且以PVY坏死株系（PVY-N)为主,重病田发生率达40%以上,并常与烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒混合侵染,严重影响烟草品质造成巨大的经济损失.

西瓜花叶病毒HC-Pro基因在毕赤酵母中的分泌表达与功能研究

利用RT-PCR方法扩增出西瓜花叶病毒HC-Pro的基因,长度为1371bp,并构建了真核表达质粒pPIC9K-WHC。将重组质粒经SalⅠ单酶切后电转化Pichia pastoris GS115菌株,经PCR鉴定与G418、MD和MM培养基筛选,获得Mut+/His+表型高拷贝转化子。经1%甲醇诱导5d后,SDS-PAGE检测发酵液上清,在66kD处有一特异蛋白条带表达。Western blot鉴定表明,表达蛋白可以和HC-Pro蛋白抗血清发生结合反应。Far-Western blot证明该蛋白能与西瓜花叶病毒CP蛋白结合,支持了HC-Pro蛋白协助传毒的"桥梁"学说。

芜菁花叶病毒两分离物的CP基因及HC-Pro基因的比较

芜菁花叶病毒杭州分离物(HZWT)和昆明分离物(YNQC)在7种寄主上的致病性相似.利用IC-RT-PCR对两分离物的CP和HC-Pro基因进行PCR扩增,扩增产物克隆后进行序列测定,CP基因序列长度均为864个核苷酸,编码288个氨基酸;HC-Pro基因序列长度均为1374个核苷酸,编码458个氨基酸.两分离物的CP和HC-Pro基因的核苷酸同源率分别为99.3%和94.5%,氨基酸同源率分别为100%和98.7%.HZWT和YNQC的CP基因与已报道的TuMV其他分离物的核苷酸序列同源率为89.2%～99.3%,氨基酸同源率分别为88.5%～99.7%;HC-Pro基因与TuMV其他分离物的核苷酸序列同源率分别为80.6%～97.0%,氨基酸同源率分别为95.0%～99.6%.

芜菁花叶病毒欧亚分离物HC-Pro基因的克隆和序列分析

16个芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）欧亚分离物分别来自奥地利、丹麦、德国、匈牙利、尼泊尔和英国6国。利用免疫捕获反转录PCR（Immunocapture RT-PCR，IC-RT-PCR）对16个分离物的HC-Pro（Helper component pro-teinase）基因进行PCR扩增，扩增产物克隆后进行序列测定，HC-PrD基因序列长度均为1374个核苷酸，编码458个氨基酸。16个分离物的HC—PrD基因核苷酸序列同源性为79．5％～99．8％，所编码的氨基酸同源性为94．1％～99．8％。对16个分离物及GenBank上已报道的其它14个TuMV的HC-Pro基因核苷酸的系统进化树分析表明：在16个TuMV欧亚分离物中，除了来自亚洲的分离物N23属Asian-BR组，其余15个来自欧洲的分离物都属于world-B组，其中分离物H1归属world-wide亚组，另外14个分离物则归属NewWorld亚组。

马铃薯Y病毒N株系HC-Pro基因在毕赤酵母中分泌表达与鉴定

以克隆载体pGEMT-PVY-NHC为模板,用PCR方法获得HC-Pro基因,构建表达载体pPIC9K-HC,将重组质粒经SalI单酶切后电转化PachiapichiaGS115菌株,筛选出对G418有高抗性和在MM培养基上生长缓慢的转化子。经摇瓶发酵和1%甲醇诱导后,SDS-PAGE检测发酵液上清,在66kD处有1个特异条带表达,目的条带蛋白占上清液总蛋白的40%。Westernblot鉴定表明,表达蛋白可以和HC抗体发生结合反应。

马铃薯Y病毒广东分离物HC-Pro基因的克隆和序列分析

利用RT-PCR法对广东烟草样品的马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)辅助成分蛋白质(Helpercomponent proteinase,HC-Pro)基因进行了克隆,并对其进行了序列分析。测序结果表明广东PVY HC-Pro(命名为PVY-HC-GD)基因(用PVY-HC-GD表示)全长1 395 bp,编码465个氨基酸。与已报道的PVY HC-Pro基因核苷酸序列相比发现,PVY-HC-GD与PVY NTN株系(PVYNTN)(AB331517)的PVYHC-Pro基因核苷酸序列相似性最高,达99.6%。而氨基酸序列比较表明,PVY-HC-GD与PVY N株系(PVYN)(AM268435)的PVY HC-Pro氨基酸序列相似性最高,为99.1%。进一步将PVY-HC-GD的核苷酸和其编码的氨基酸序列与其他报道的同源基因比对构建了系统关系树,结果显示广东烟草样品中PVY-HC-GD与PVYNTN PVY HC-Pro亲缘关系最近。

芜菁花叶病毒分离物NBXC的CP和HC-Pro基因克隆与序列分析

从浙江宁波雪菜上获得病毒分离物NBXC,病毒提纯后,电镜下可观察到大量长约740 nm的线形粒子。间接ELISA检测结果证实NBXC是芜菁花叶病毒(turnip mosaic virus,TuMV)的分离物。利用IC-RT-PCR对病毒分离物NBXC的CP和HC-Pro基因进行PCR扩增,分别得到约0.8 kb和1.4 kb的两条条带,与预期的TuMV CP和HC-Pro基因大小吻合。扩增产物克隆后进行序列测定,CP基因序列长度为864个核苷酸,编码288个氨基酸;HC-Pro基因序列长度为1374个核苷酸,编码458个氨基酸。NBXC的CP和HC-Pro基因与已报道的TuMV其他分离物的核苷酸序列同源率分别为90.0%～98.3%和82.2%～96.9%,氨基酸同源率分别为95.8%～99.3%和95.6%～99.3%。从CP和HC-Pro基因核苷酸序列同源性来看,NBXC与TuMV芸薹属分离物有更近的亲缘关系,而与萝卜属分离物亲缘关系较远。

马铃薯Y病毒属病毒HC-Pro蛋白功能研究进展

马铃薯Ｙ病毒属病毒基因组编码的ＨＣ－Ｐｒｏ 蛋白（蚜传辅助因子）具有多种功能，在病毒生活史各个环节中起重要作用。ＨＣ－Ｐｒｏ 蛋白具有蛋白酶活性，作为蚜传辅助因子参与病毒蚜传过程，调节病毒在宿主体内的转移，并在病毒复制、宿主症状表达及增强异源病毒复制等方面发挥作用。本文对ＨＣ－Ｐｒｏ 蛋白的既定、预测功能作一综述。深入了解ＨＣ－Ｐｒｏ 蛋白的功能不仅在理论上有助于明确病毒生活周期。

利用GATEWAY^(TM)技术快速构建番木瓜环斑病毒HC-pro基因的RNAi表达载体

通过RT-PCR扩增番木瓜环斑PRSV病毒HC-pro基因,序列比对结果表明,克隆到的该基因片段与已知的海南或华南地区已克隆的HC-pro基因只有约92%的同源性,说明PRSV病毒具有较大的变异性。为了培育番木瓜转基因抗病植株,利用pWATERGATE载体和GATEWAYTM技术,成功构建了番木瓜环斑病毒HC-pro基因的RNAi表达载体。具体步骤如下:①设计带特异性重组序列attB的HC-pro基因PCR的引物;②利用该引物进行RT-PCR扩增HC-pro基因;③通过BP反应,将扩增得到的HC-pro基因序列插入入门载体pDONR201中;④通过LR反应将HC-pro基因序列从pDONR201重组到目标载体pWATERGATE中,得到PRSVHC-pro基因的RNAi表达载体。

利用PLDMV/Twin-Strep侵染性克隆纯化HC-Pro病毒蛋白

番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)是一种新的潜在威胁番木瓜种植业的病毒,其辅助成分蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)是PLDMV编码参与病毒复制、运动、寄主植物症状表现的多功能蛋白,因此纯化获得具有功能活性的HC-Pro蛋白,研究其多功能性具有重要意义。本研究利用In-Fusion拼接策略和E.coli Cell-Free快速构建植物病毒侵染性克隆法,一步快速地将28个氨基酸组成的蛋白标签Twin-Strep插入到PLDMV HC-Pro氨基端,成功获得了基于农杆菌的携带Twin-Strep标签的PLDMV侵染性克隆pPLDMV-Strep。通过农杆菌渗透注射接种番木瓜植株,从感染PLDMV-Strep的番木瓜叶片总蛋白中,利用Twin-Strep蛋白标签亲和层析分离纯化获得PLDMVHC-Pro蛋白,并通过LC/ESI-MS/MS(liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometric)对其进行蛋白N端和C端序列测序,证明了纯化获得完整的PLDMVHC-Pro蛋白。研究结果为后续解析PLDMV HC-Pro在病毒侵染过程中的功能及与寄主蛋白相互作用奠定了基础。