HCCR-2干扰真核表达载体的构建及其稳定转染细胞系的建立

目的构建HCCR-2干扰真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的HepG2细胞系。方法人工合成HCCR-2基因干扰序列并定向插入到RNAi真核表达载体pGenesil-1,通过测序鉴定。将干扰质粒用脂质体法转染HepG2细胞,经G418持续压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系。RT-PCR检测筛选克隆HCCR-2 mRNA的表达水平。结果测序表明HCCR-2干扰序列及读框完全正确,干扰质粒稳定转染的HepG2细胞系在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光。RT-PCR结果显示RNAi-H1、RNAi-H3序列对HCCR-2 mRNA有较好的抑制效果。结论成功构建了HCCR-2干扰真核表达载体,HCCR-2干扰质粒稳定转染的HepG2细胞系的建立为进一步研究HCCR-2在肝癌细胞中的作用奠定了基础。

人子宫颈癌基因HCCR-2反义真核表达载体的构建及鉴定

目的克隆人子宫癌基因HCCR-2并构建其反义真核表达载体。方法从人肝癌细胞株HepG2提取RNA,利用RT-PCR方法,克隆出一包括HCCR-2编码区的长约1kb的片段,并将其与T载体连接,测序证实无误后,用SalⅠ、SacⅡ双酶切重组T载体,然后将该片段反向插入真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点,最后对重组真核表达载体进行双酶切鉴定。结果RT-PCR扩增出一长约1kb的HCCR-2片段,琼脂糖凝胶电泳显示目的片段成功反向连接到pIRES2-EGFP载体上。结论成功克隆了HCCR-2基因并构建了其反义真核表达载体pIRES2-EGFP/HCCR-2(-)。

反义HCCR-2转染对肝癌细胞HepG2形态的影响

目的研究HCCR-2反义基因转染对肝癌HepG2细胞株形态学的影响。方法用脂质体法将HCCR-2反义真核表达载体导入HepG2细胞,从光镜、HE染色、荧光显微镜、电镜水平观察转染前后细胞形态学的改变。结果与亲本细胞相比,光镜及HE染色下转染HCCR-2反义基因的HepG2细胞变得狭长,胞体增大,胞浆丰富,分裂相减少,核浆比下降,异型性减少;荧光显微镜下反义基因转染细胞发出绿色荧光,透射电镜下反义基因转染细胞出现凋亡。结论 HCCR-2反义基因可以促进HepG2细胞的分化。

人子宫颈癌基因HCCR-2真核表达载体的构建及鉴定

目的:克隆人子宫癌基因HCCR-2并构建其真核表达载体,为研究其在人胃癌细胞中与P53的相互作用关系奠定基础.方法:从人肝癌细胞株HepG2提取RNA,利用RT-PCR方法,先克隆出一包括HCCR-2编码区的长约1kb的片段,并将其与T载体连接并转化,测序证实无误后,以HCCR-2/T载体为模板,再通过PCR克隆出HCCR-2的编码区序列,将其连接到pIRES2-EGFP真核表达载体,并通过测序获得证实.结果:RT-PCR扩增出一长约1kb的HCCR-2片段,PCR扩增出约0.9kb大小的目的片段,HCCR-2/T,pIRES2-EGFP/HCCR-2(+)DNA测序均表明编码序列及读框完全正确.结论:成功构建HCCR-2真核表达载体pIRES2-EGFP/HCCR-2(+),为进一步研究其致癌机制打下基础.

HCCR-2基因沉默后HepG2肝癌细胞形态变化

目的研究HCCR-2基因表达沉默后肝癌细胞HepG2形态学的变化.方法将经测序证实的干扰质粒用脂质体法转染HepG2细胞,经G418持续压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系.分别用光镜、HE染色、荧光显微镜、透射电镜观察HepG2细胞转染前后形态学的改变.结果与亲本细胞相比,HCCR-2沉默后,HepG2细胞呈梭形,核浆比例有所下降,透射电镜下可观察到细胞核收缩变圆,胞质浓缩,细胞核中染色质边集、皱缩,密度增高.结论 RNAi介导的HCCR-2基因沉默可以促进HepG2细胞形态的改变及凋亡.

HCCR-2反义核酸对肝癌HepG2细胞的作用

目的研究反义HCCR-2真核表达载体对肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响。方法构建反义HCCR-2真核表达载体（反义载体组），转染肝癌HepG2细胞，G418筛选阳性克隆，同样方法获得空载体pIRES2-EGFP稳定表达的细胞株（空载体组），取肝癌HepG2细胞为对照（肝癌HepG2组），用MTT法、流式细胞仪、透射电镜观察反义HCCR-2转染前后肝癌HepG2细胞生长曲线、细胞周期、细胞凋亡及细胞形态的变化。采用单因素方差分析和χ^2检验比较各组差异。结果反义载体组、空载体组、肝癌HepG2组HCCR-2 mRNA表达水平分别为0．39±0．04、0．62±0．06、0．72±0．03，3组比较差异有统计学意义（F=43．701，P〈0．05）；细胞凋亡率分别为13．30％、2．51％、2．07％，反义载体组与空载体组、肝癌HepG2组比较，差异有统计学意义（χ^2=6．793，8．721，P〈0．05）；反义载体组细胞生长减慢，阻滞于G0／G1期。结论HCCR-2反义核酸真核表达载体能抑制HCCR-2 mRNA的表达，促进细胞凋亡，HCCR-2蛋白可能参与肝癌细胞的周期调控，并与细胞的生长增殖有关。

人子宫颈癌基因-2干扰抑制HepG2肝癌细胞mRNA的表达

目的利用构建的特异性针对HCCR-2的干扰质粒RNAi-H1,研究HCCR-2干扰对HepG2肝癌细胞mRNA的影响.方法将干扰质粒用脂质体法转染HepG2细胞,经G418持续压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系.Real-timePCR检测HCCR-2mRNA表达水平.结果Real-time PCR结果表明HepG2-H1mRNA表达明显减少.结论HCCR-2干扰可以抑制HepG2肝癌细胞mRNA的表达.