流式细胞术分析HCMV—PP65抗原在外周血各有核细胞群上的表达及意义

目的研究分析人外周血有核细胞感染人类巨细胞病毒PP65抗原（Human Cytomegalovirus PP65 antigen，HCMV—PP65Ag）的阳性表达率及临床意义。方法应用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）对广州军区广州总医院2007年1月～2008年12月共256例患者的外周血有核细胞HCMV—PP65Ag阳性表达百分率进行分析，其中移植组80例，肿瘤组48例，肾功能不全组86例，其它疾病组42例；设门诊健康体检者20例为正常对照组。对HCMV检出阳性患者根据并发细菌感染与否分为两组，观察两组间临床治疗方案的选择。另对26例HCMV现症感染患者进行连续四周检测，动态观察HCMV—PP65Ag的表达与临床症状的关联。结果256例患者共检出144例HCMV—PP65Ag阳性；HCMV-PP65Ag阳性患者中并发细菌感染与无细菌并发感染两组临床发热娃状及临床用药方案间比较差异均有统计学显著性意义（均P〈0．05）。动态观察组监测结果显示，持续HCMV—PP65Ag检测阳性患者，尤其是粒细胞群表达阳性时，临床多表现有发热症状及易并发细菌感染。结论运用FCM检测人外周血有核细胞表面HCMV—PP65Ag，能快速、准确、有效地提供HCMV感染依据；而对HCMV感染的各细胞群进行分析，有利于临床了解疾病情况和制订治疗方案。

肿瘤及胚胎组织特异表达蛋白65与低密度脂蛋白受体相关蛋白关联蛋白的结合

目的:寻找与肿瘤及胚胎组织特异表达蛋白65(cancerandembryoexpressionprotein65,CEP65)相互结合的蛋白分子,为研究CEP65在肿瘤发生中的作用机制提供线索。方法: 以CEP65为诱饵蛋白,通过酵母双杂交方法, 筛选人胚胎组织cDNA表达文库。将获得的阳性克隆cDNA片段分别克隆到原核和哺乳细胞表达质粒,通过GSTpull down和免疫共沉淀对相互作用蛋白作进一步验证。结果: 筛选到能与CEP65相互结合的低密度脂蛋白受体相关蛋白产关联蛋白(lowdensitylipoproteinreceptor relatedprotein associatedprotein1,RAP)。将分别在原核和哺乳细胞中表达的RAP与CEP65进行GSTpull down实验,结果显示,原核表达的GST RAP可以与His CEP65相互结合,而在哺乳细胞共表达的GST CEP65和Myc RAP也能相互结合。结论:RAP可以和CEP65相结合,CEP65有可能通过与RAP相互作用,在肿瘤的浸润、转移及增生中发挥其功能。

外周血白细胞HCMV PP65抗原检测结果分析

目的分析外周血白细胞巨细胞病毒(HCMV)PP65抗原检测结果,总结儿科常见疾病的HCMV感染情况及HCMV感染所致临床疾病的分布情况。方法采用间接免疫荧光法检测了1016例儿童外周血白细胞HCMVPP65抗原,对检测结果及阳性病例进行分析。结果所有送检标本总阳性检出率为25.2%,以肝炎、婴儿肝炎综合征组患儿阳性检出率最高,分别为37.8%、32.4%。CMV感染可累及全身各个系统,引起疾病多样,但以婴儿肝炎综合征最多见(37.1%),其次为高胆红素血症(12.9%)、急性呼吸道感染(10.9%)、腹泻(9.4%)、发热待查(6.6%)、肝炎(5.5%)等。结论HCMV感染临床上常见,症状多样,临床医生对可疑病例应及早作相应的实验室检查,以助于早期临床诊断,并指导有效的治疗。

HBcAg基因和PreS1(1～65)肽基因真核重组载体的构建和鉴定

目的：构建并鉴定包含人乙型肝炎病毒（HBV）HBcAg基因和PreS1（1～65）肽基因的真核重组载体。方法：采用PCR法扩增HBcAg基因，并通过基因突变在79～80位氨基酸处生成一个NheⅠ酶切位点，然后将这段基因连接到真核表达载体pIRES2-EGFP启动子下游的EcoRⅠ和BamHⅠ之间。同时PCR扩增PreS1第1～65氨基酸基因，并在其两端分别引入NheⅠ酶切位点，通过酶切、连接，将这段基因插入到HBcAg基因的NheⅠ酶切位点上。将构建的重组载体pIREScS1转化大肠杆菌DH5α，分别用上述内切酶双酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果：酶切鉴定示，插入片段大小均与预计相符。测序结果与已知序列结果一致。结论：成功构建了HBcAg基因和PreS1（1～65）肽基因的真核重组载体。

人巨细胞病毒激活感染与颈动脉粥样硬化斑块不稳定性的临床研究

目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)激活感染与颈动脉粥样硬化的关系。方法采用免疫荧光法检测外周血白细HCMV-PP65抗原作为HCMV激活感染的指标,对212例颈动脉粥样硬化患者分别进行HCMV-PP65抗原、血清基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平检测和颈动脉超声检查。结果 HCMV-PP65抗原阳性组、阴性组血清MMP-9含量分别为(242.25±81.03)、(159.57±79.20)pg/mL,差异有统计学意义(P<0.01);两组TNF-α含量分别为(3.04±0.37)、(1.37±0.17)ng/mL,差异有统计学意义(P<0.01);HCMV-PP65抗原阳性组44例(69.84%)存在不稳定性斑块,HCMV-PP65抗原阴性组72例(48.32%)存在不稳定性斑块,差异有统计学意义(χ2=8.82,P<0.01)。结论人巨细胞病毒激活感染可引起MMP-9、TNF-α水平增高,可能与颈动脉粥样硬化斑块不稳定性有关。

孕早期HCMV活动性感染实验室诊断方法的比较和评价

目的 比较和评价人巨细胞病毒（HCMV） pp65抗原、IgM抗体和DNA三种检测方法对孕早期HCMV活动性感染的临床诊断应用价值.方法 采集临床疑似孕早期HCMV活动性感染的孕妇血标本（共200份）,分离血浆和白细胞涂片、固定,分别用于HCMV-IgM抗体检测、荧光定量HCMV DNA检测和HCMV-pp65抗原检测,三种方法作平行比较.结果 pp65抗原检测的检出率明显高于IgM抗体检测（P＜0.05）,与IgM抗体检测的符合率为85％;与HCMV DNA检测比较,pp65抗原检测法的符合率为96％,一致性较好,两者之间的阳性检出率差异无统计学意义（P＞0.05）,而且高pp65抗原血症与患者的临床症状密切相关.结论 pp65抗原血症反映该病毒活动状况,比目前广泛采用的血清HCMV-IgM抗体检测法能更好的监测孕早期HCMV活动性感染,提高临床的诊断率.与荧光定量PCR检测法比较方法简便,检测费用低,并且二者阳性检出率无明显差异.

2项对诊断儿童人巨细胞病毒活动性感染的比较

目的比较血清人巨细胞病毒(HCMV)-IgM抗体(以下简称IgM抗体)与HCMV pp65抗原(以下简称pp65)两种方法对HCMV活动性感染诊断检测的实用意义。方法采集临床疑似HMCV活动性感染儿童血标本91份,分离血浆和多形白细胞,分别用于IgM抗体检测和pp65抗原检测,同时用聚合酶链反应(PCR)检测HCMV DNA,与pp65抗原作平行比较。结果 pp65抗原检测的结果与IgM抗体检测的符合率为70.3%,与HC-MV DNA检测相比,pp65抗原检测的符合率、特异性和敏感度分别为85.5%、70.6%和75.6%,而且高pp65抗原血症与患者临床症状密切相关。结论 pp65抗原血症反映该病毒活动状况,可监测HCMV活动性感染。

融合蛋白G3G6和HST1致敏DC疫苗抗黑色素瘤的药效学研究

探究促性腺激素释放激素(GnRH)与胃泌素释放肽(GRP)偶联的融合蛋白(G3G6)和热休克蛋白65(HSP65)与六跨膜前列腺上皮抗原(STEAP1)偶联的融合蛋白(HST1)致敏树突状细胞(DC)的效果和致敏后DC对B16F10黑色素瘤的抑制杀伤作用。利用实验室现存工程菌表达融合蛋白G3G6和HST1,按未致敏DC(US-DC)组,G3G6融合蛋白致敏DC(G3G6-DC)组,HST1融合蛋白致敏DC(HST1-DC)组和G3G6及HST1联合致敏DC(GH-DC)组致敏小鼠骨髓来源的DC分化成熟,获得融合蛋白致敏的相应DC疫苗。将B16F10黑色素瘤细胞以1×10~6个/只移植于C57BL/6J雄性小鼠构建黑色素瘤模型,DC疫苗免疫治疗,体内外实验探究DC疫苗的抗肿瘤药效。流式细胞术分析证明,融合蛋白有效刺激DC分化成熟;动物实验显示,与US-DC组相比,G3G6-DC黑色素瘤抑制率为35.75%,HST1-DC组为34.03%,GH-DC组为55.74%。研究结果初步证明,G3G6-DC和HST1-DC均可有效抑制黑色素瘤B16F10细胞小鼠移植瘤的生长(P<0.05),且联合用药优于单独用药(P<0.01)。

热休克蛋白65增强小鼠对HBV DNA疫苗免疫反应的研究

目的：观察热休克蛋白65的真核表达载体（pHSP65）对HBVDNA疫苗诱导BALB／c小鼠（H-2^d）免疫应答的调节作用。方法：肌内注射空栽体pcDNA3，HBVDNA疫苗加HSP65佐剂（pHBVS2S＋pHSP65）或不加佐剂（pHBVS2S）；ELISA法测定血清抗HBs抗体；ELISPOT检测分泌IFN-γ的脾淋巴细胞；4h^51Cr释放法检测小鼠脾细胞CTLs活性。结果：HBVDNA佐剂组免疫小鼠抗HBsAg抗体滴度虽高于不加佐剂组，但无显著性差异；其IgG1／IgG2a的比例不同于多肽免疫组，二者分别为0．395与10。佐剂组小鼠分泌IFN-γ的脾淋巴细胞量是不加佐剂组的2—3倍。CTL与细胞杀伤活性（E：T=100）佐剂组与不加佐剂组分别为：（53．68±7．5）％、（42．81±7．7）％，差异显著（P〈0．05）。结论：HBVDNA疫苗具有较强的免疫原性，能够诱导机体产生特异性的抗体及CTLs反应；HSP65佐剂能够有效提高小鼠对DNA疫苗的细胞免疫应答，有望成为DNA疫苗的免疫佐剂。

HCMVpp65抗原、HCMV mRNA和IgM抗体检测在诊断HCMV活动性感染中的比较

目的比较人巨细胞病毒(HCMV)pp65抗原、HCMV mRNA和血清HCMV-IgM抗体检测3种方法在诊断HCMV活动性感染中的实用意义。方法采集医院TORCH检查HCMV-IgM阳性的病人外周血(60份)。将标本分2份2ml和3ml,别用于HCMVmRNA和pp65检测。将三者结果进行比较。结果pp65抗原检测的结果与IgM抗体检测的阳性符合率为81.67%。与HCMV mRNA检测相比pp65抗原检测法的符合率、特异度和敏感度分别为81.67%,81.81%和81.63%。而且高pp65抗原血症与患者的临床症状密切相关。结论pp65抗原血症反映该病毒活动状况,可监测HCMV活动性感染,联合HCMV-IgM的检测可以提高临床的诊断率并可用于指导临床用药及监测药物疗效。

流式细胞术检测人巨细胞病毒活动性感染检测方法的建立及检测效果评价

探讨流式细胞术检测人巨细胞病毒活动性感染检测方法的可行性及效果评价。分离人外周血白细胞,以商品化的小鼠抗人巨细胞病毒pp65抗原单克隆抗体为一抗,FITC标记的羊抗小鼠IgG抗体为二抗,采用流式细胞术对外周血人巨细胞病毒pp65抗原进行检测。同时采用间接免疫荧光法对外周血人巨细胞病毒pp65抗原进行检测。采用配对χ2检验对两种方法的检测效果进行评价。临床送检的65份疑似为人巨细胞病毒感染病人外周血标本中,间接免疫荧光法检出阳性9份,流式细胞术检出阳性11份,两种方法阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。采用流式细胞术可定量检测外周血人巨细胞病毒pp65抗原,与间接免疫荧光法检测结果无统计学差异,可在临床推广使用。

人巨细胞病毒感染母婴传播与母乳喂养

目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)母婴传播中的母乳喂养与婴儿HCMV感染的关系,进而指导感染人巨细胞病毒母乳对婴儿的合理喂养。方法应用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法分别检测113对临床疑诊HCMV感染患儿及其母亲HCMV-DNA含量,用免疫荧光法检测患儿血HCMV-PP65抗原。结果母乳HCMV-DNA与配对患儿血HCMV-PP65抗原两者之间有关联(χ2=6.48,0.01<P<0.025),但关系不是非常密切,阳性母乳配对患儿与阴性母乳配对患儿的血HCMV-DNA之间差异无统计学意义(t=1.432,P>0.05)。结论母乳HCMV感染是婴儿获得HCMV感染的重要途径,但是二者关联性不强,故对已感染HCMV的患儿建议母乳喂养,对母亲HCMV阳性,而婴儿HCMV阴性的可将乳汁处理后喂养,更加安全。

血液病患者人巨细胞病毒感染的实验室诊断

[目的]探讨人巨细胞病毒(HCMV)在血液病患者中的感染状况。[方法]共收集到血液病患者136例,应用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定HCMV-IgG和HCMV-IgM,应用实时荧光定量—多聚酶链反应(real-time PCR)和细胞免疫组化染色法检测外周血白细胞中HCMV-DNA和HCMV-pp65抗原。[结果]血液病患者HCMV-IgG、HCMV-IgM、HCMV-DNA和HCMV-pp65阳性检出率分别为99.3%、2.2%、18.8%和12.5%。而健康对照组除HCMV-IgG阳性率为100%外,其余均为阴性。[结论]血液病患者存在不同程度的HCMV感染。临床上开展HCMV抗原、抗体及核酸的检测,对血液病患者早期防治HCMV感染具有重要意义。

猪圆环病毒2型两种重组多表位蛋白免疫效果的评价

Cap蛋白和Rep蛋白是猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2)的2个主要蛋白,其中含有很多表位。本研究合成了由3个Cap蛋白表位和1个Rep蛋白表位组成的2个表位串联体,利用NcoⅠ、SpeⅠ和SalⅠ位点,将Hsp65基因与表位串联体依次克隆到pET30a,把构建的重组表达质粒PHE转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,诱导重组蛋白的表达。将表达的两种重组蛋白HSP-e-1和HSP-e-2纯化复性后分别免疫小鼠,结果被免疫的小鼠产生特异性抗体,其中HSP-e-2产生的抗体水平较高,而HSP-e-1的淋巴细胞增殖结果要优于HSP-e-2。结果表明,牛型分枝杆菌Hsp65能够作为多表位肽的载体,而融合蛋白HSP-e-1和HSP-e-2可作为PCV2新型疫苗的候选物。

人类巨细胞病毒感染与1型糖尿病的相关性研究

目的探讨HCMV感染与1型糖尿病的相关性。方法利用ELISA技术检测血清抗HCMV-IgG、抗HCMV-IgM,并计算抗HCMV-IgG的抗体指数;用酶免疫组化技术检测HCMV病毒复制标志物HCMV-pp65表达水平。结果1型糖尿病患者抗HCMV-IgM、HCMV-pp65的检出率分别为31.7%、46.5%,均显著高于对照组(χ2=14.691,P<0.05;χ2=24.810,P<0.05)。同时HCMV-pp65的检出率显著高于抗HCMV-IgM(χ2=4.677,P=0.03)。≤10岁及11～20岁年龄组抗HCMV-IgM及HCMV-pp65阳性率高于其它各年龄组(P<0.05);21～30岁年龄组,HCMV-pp65的检出率高于抗HCMV-IgM(χ2=4.600,P=0.032)。各年龄组抗HCMV-IgG检出率与对照组无显著差异(χ2=3.267,P=0.07),但抗HCMV-IgG抗体指数显著高于对照组(t=2.601,P=0.01)。结论HCMV感染与1型糖尿病发病密切相关。