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Protective Effect of Reduced Glutathione C_(60) Derivative against Hydrogen Peroxide-induced Apoptosis in HEK 293T Cells 被引量:1
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作者 黄锦 周迟 +3 位作者 贺军 胡铮 官文超 刘胜洪 《Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences)》 SCIE CAS 2016年第3期356-363,共8页
Hydrogen peroxide(H_2O_2) and free radicals cause oxidative stress, which induces cellular injuries, metabolic dysfunction, and even cell death in various clinical abnormalities. Fullerene(C_(60)) is critical fo... Hydrogen peroxide(H_2O_2) and free radicals cause oxidative stress, which induces cellular injuries, metabolic dysfunction, and even cell death in various clinical abnormalities. Fullerene(C_(60)) is critical for scavenging oxygen free radicals originated from cell metabolism, and reduced glutathione(GSH) is another important endogenous antioxidant. In this study, a novel water-soluble reduced glutathione fullerene derivative(C_(60)-GSH) was successfully synthesized, and its beneficial roles in protecting against H_2O_2-induced oxidative stress and apoptosis in cultured HEK 293 T cells were investigated. Fourier Transform infrared spectroscopy and 1H nuclear magnetic resonance were used to confirm the chemical structure of C_(60)-GSH. Our results demonstrated that C_(60)-GSH prevented the reactive oxygen species(ROS)-mediated cell damage. Additionally, C_(60)-GSH pretreatment significantly attenuated H_2O_2-induced superoxide dismutase(SOD) consumption and malondialdehyde(MDA) elevation. Furthermore, C_(60)-GSH inhibited intracellular calcium mobilization, and subsequent cell apoptosis via bcl-2/bax-caspase-3 signaling pathway induced by H_2O_2 stimulation in HEK 293 T cells. Importantly, these protective effects of C_(60)-GSH were superior to those of GSH. In conclusion, these results suggested that C_(60)-GSH has potential to protect against H_2O_2-induced cell apoptosis by scavenging free radicals and maintaining intracellular calcium homeostasis without evident toxicity. 展开更多
关键词 reduced glutathione C60 derivative hydrogen peroxide oxidative stress apoptosis hek 293t cells
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再生基因4(REG4)真核表达载体的构建及其蛋白在HEK293T细胞中的表达、纯化 被引量:1
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作者 徐杨 杜惠芬 +4 位作者 李克生 柴丹丹 石晓玲 连晓雯 张学良 《现代检验医学杂志》 CAS 2023年第4期35-39,共5页
目的构建再生基因4(regenerating gene 4,REG4)的真核表达载体,转染人胚肾细胞293T(human embryonic kidney 293T cells,HEK 293T),获得重组人再生胰岛衍生蛋白IV(regenerating islet-derived protein IV,Reg IV)。方法根据NCBI数据库R... 目的构建再生基因4(regenerating gene 4,REG4)的真核表达载体,转染人胚肾细胞293T(human embryonic kidney 293T cells,HEK 293T),获得重组人再生胰岛衍生蛋白IV(regenerating islet-derived protein IV,Reg IV)。方法根据NCBI数据库REG4基因序列进行基因优化、合成,将其克隆至pCDNA3.4载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)将pCDNA3.4-REG4质粒瞬时转染至HEK 293T细胞(实验组),同时以pEGFP-C1质粒作为转染对照组,未转染重组质粒的HEK 293T细胞作为空白对照组。荧光显微镜观察转染对照组转染效率,分别收集实验组及空白对照组细胞和细胞培养液上清,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)与免疫印迹试验(Western-Blot,WB)检测Reg IV蛋白表达水平。通过镍柱及丙烯葡聚糖凝胶S-400(Sephacryl S-400)柱进行蛋白纯化,SDS-PAGE及WB对纯化后重组蛋白进行鉴定。结果经测序和双酶切鉴定,重组质粒pCDNA3.4-REG4构建成功。转染对照组(pEGFP-C1质粒)荧光显微镜观察结果显示转染效率约50%,表明转染成功。WB结果显示仅在实验组(pCDNA3.4-REG4质粒)的细胞中检测到RegIV蛋白。镍柱纯化时目的蛋白无法与镍柱填料有效结合,SephacrylS-400凝胶柱层析纯化获得了此重组蛋白。结论成功构建了REG4基因真核表达载体并在HEK 293T细胞中成功表达,为深入研究Reg IV蛋白的作用机理及开发潜在的抗癌靶向药物奠定了基础。 展开更多
关键词 再生基因4 再生胰岛衍生蛋白Ⅳ 真核表达 人胚肾细胞293t 瞬时转染 蛋白纯化
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HEK 293T细胞中TRAF6多聚泛素化修饰KLF5的方式及其修饰位点的鉴定 被引量:1
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作者 李玉 应帅 +6 位作者 葛文 阮玉婷 吴宁霞 王伟民 张婧 邱文 王迎伟 《南京医科大学学报(自然科学版)》 CAS 北大核心 2023年第4期445-451,共7页
目的:研究人胚肾293T(HEK 293T,简称293T)细胞中外源性肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor⁃associated factor 6,TRAF6)与Krüppel样因子5(Krüppel⁃like factor 5,KLF5)的结合及TRAF6多聚泛素化修饰KLF... 目的:研究人胚肾293T(HEK 293T,简称293T)细胞中外源性肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor⁃associated factor 6,TRAF6)与Krüppel样因子5(Krüppel⁃like factor 5,KLF5)的结合及TRAF6多聚泛素化修饰KLF5的方式和修饰的位点。方法:将构建的Flag⁃TRAF6、HA⁃KLF5、泛素过表达质粒、shTRAF6小干扰质粒和TRAF6 C70A位点突变质粒行不同组合转染293T细胞48 h。用免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)和免疫印迹(immunoblotting,IB)实验检查TRAF6与KLF5的结合以及KLF5 K63或K48多聚泛素化水平。此外,构建KLF5全部赖氨酸突变的质粒,分别与TRAF6质粒共转染293T细胞。用前述IP/IB检测KLF5 K63连接的多聚泛素化修饰,并确定KLF5 K63泛素化修饰的位点。结果:293T细胞中TRAF6能与KLF5结合;TRAF6过表达和基因沉默或TRA6酶活性缺失能相应上调或下调KLF5 K63的多聚泛素化;KLF5被TRAF6 K63多聚泛素化修饰的位点是其第99位和第100位的赖氨酸。结论:TRAF6能与KLF5相互作用,并对KLF5⁃K99和K100进行K63多聚泛素化修饰。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子受体相关因子6 Krüppel样因子5 K63连接的多聚泛素化修饰 hek 293t细胞
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人源WNT16 HEK 293T稳转细胞株构建、蛋白纯化与活性检测方法研究
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作者 王克芬 陈海迪 +3 位作者 章嘉成 周鑫 邓成 武永康 《四川医学》 CAS 2023年第12期1233-1238,共6页
目的无翅型MMTV整合位点家族成员16(WNT16)是一种重要的信号调节蛋白,参与多种细胞生物学过程的调控。本研究旨在构建稳定转染WNT16基因的HEK 293T细胞株,并利用多聚赖氨酸标签(HIS-Tag)实现高效纯化WNT16蛋白。方法使用TK-PCDH-copGFP-... 目的无翅型MMTV整合位点家族成员16(WNT16)是一种重要的信号调节蛋白,参与多种细胞生物学过程的调控。本研究旨在构建稳定转染WNT16基因的HEK 293T细胞株,并利用多聚赖氨酸标签(HIS-Tag)实现高效纯化WNT16蛋白。方法使用TK-PCDH-copGFP-T2A-Puro载体,将WNT16 CDS-HIS序列通过XbaI和BamHI位点连接载体,构建慢病毒载体质粒;将该质粒与pSPAX2和pMD2.G一起共转染HEK 293T细胞,制备携带WNT16基因的慢病毒;利用慢病毒感染HEK 293T细胞,并通过嘌呤霉素筛选和Western Blot鉴定稳定过表达WNT16的细胞株;利用镍螯合琼脂糖凝胶与HIS标签的高亲和性纯化WNT16蛋白,使用考马斯亮蓝染色和Western Blot法检测纯化效果;用纯化的WNT16蛋白刺激Jurkat细胞,使用Western Blot法检测Jurkat细胞中β-catenin信号通路蛋白的水平,以评估WNT16蛋白的活性。结果成功构建过表达WNT16基因的慢病毒表达载体,并用其感染HEK 293T细胞。经过嘌呤霉素筛选和Western Blot鉴定,我们获得了稳定表达WNT16的HEK 293T细胞株。使用HIS标签成功纯化了WNT16蛋白,并用考马斯亮蓝染色和Western Blot法检测了纯化效果。最后,我们用纯化的WNT16蛋白刺激Jurkat细胞,并用Western Blot法检测了Jurkat细胞中β-catenin信号通路蛋白的水平,WNT16蛋白能够显著增加Jurkat细胞中β-catenin蛋白的表达,表明纯化的WNT16蛋白具有激活WNT/β-catenin通路的生物学活性。结论本研究成功实现了WNT16蛋白的高效表达和纯化,并初步研究了其功能。这为进一步探究WNT16在细胞生物学中的作用提供了重要的实验基础。 展开更多
关键词 WNT16 hek 293t细胞 过表达 稳转细胞株 纯化 HIS标签
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Cellular Oxidative Damage of HEK293T Cells Induced by Combination of CdCl_2 and Nano-TiO_2 被引量:1
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作者 夏彬 陈建伟 周宜开 《Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences)》 SCIE CAS 2011年第3期290-294,共5页
This study investigated the conjoined cellular oxidative damage of human embryo kidney 293T(HEK293T) cells induced by cadmium chloride(CdCl2) and nanometer titanium dioxide(nano-TiO2).RT-PCR technique was used t... This study investigated the conjoined cellular oxidative damage of human embryo kidney 293T(HEK293T) cells induced by cadmium chloride(CdCl2) and nanometer titanium dioxide(nano-TiO2).RT-PCR technique was used to detect the expressions of Heme oxygenase-1(HO-1) and 8-oxoguanine DNA glycosylase(OGG1).The activities of superoxide dismutase(SOD) and catalase enzyme(CAT) and concentrations of reactive oxygen species(ROS) and maldondialdehyde(MDA) were measured by different approaches.The results showed that CdCl2 and nano-TiO2 at a low concen-tration of 0.75 total toxic unit(TU) exerted an additive effects on HO-1 gene expression,CAT activities and MDA concentrations.When the total TU was increased to 1 or 1.25 TU,the interaction was syner-getic.Moreover,the mixture with high proportion of CdCl2 produced an additive effect on the OGG1 gene expression,and the interaction was changed to be synergetic when the concentration of CdCl2 was lower than or equal to that of nano-TiO2.Synergetic effects of CdCl2 and nano-TiO2 on cellular oxida-tive damage of HEK293T cells were found as indicated by the changes in the SOD activities and ROS concentrations.It was concluded that CdCl2 and nano-TiO2 exerts synergistic effects on the cellular oxidative damage of HEK293T cells,and the sensitivity of these indicators of oxidative damage varies with the proportion of CdCl2 and nano-TiO2 in the mixture. 展开更多
关键词 cadmium chloride NANO-TIO2 oxidative damage hek293t cells
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犬β防御素-1真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达 被引量:4
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作者 靳慧君 仲飞 +3 位作者 吴凌娟 解民 王微 韩冬梅 《动物学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2008年第5期897-902,共6页
哺乳动物的β-防御素是一类具有广谱抗微生物活性的阳离子小肽。为了克隆和分析犬β防御素-1基因,并建立一套在HEK293T细胞中高效表达犬β防御素-1的方法,本研究采用RT-PCR方法从犬睾丸组织中扩增出犬β防御素-1(cBD-1)的cDNA基因,并将... 哺乳动物的β-防御素是一类具有广谱抗微生物活性的阳离子小肽。为了克隆和分析犬β防御素-1基因,并建立一套在HEK293T细胞中高效表达犬β防御素-1的方法,本研究采用RT-PCR方法从犬睾丸组织中扩增出犬β防御素-1(cBD-1)的cDNA基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建了犬β防御素-1基因的真核表达载体pcDNA3.1A-cBD-1,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:克隆的犬β防御素-1基因序列与已发表序列(GenBank编号:NM-001024641)的同源性为99.7%。表达犬β防御素-1经Western-blot检测,证明构建的犬β防御素-1基因表达载体能够在真核细胞中表达,表达产物能够分泌到细胞外。为进一步研究犬β防御素的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 犬β防御素-1 载体构建 hek293t细胞 表达
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SNAPIN基因对受体酪氨酸激酶c-MET在HEK 293T细胞中表达的影响
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作者 高迎春 张传领 +3 位作者 牛丽丽 温建勋 程国强 肖瑞 《山西医科大学学报》 CAS 2015年第8期724-728,共5页
目的探讨HEK 293T细胞中受体酪氨酸激酶c-MET的表达是否受SNAPIN基因表达的影响。方法构建pEGFPSNAPIN荧光蛋白表达载体,并将pEGFP-SNAPIN荧光蛋白表达载体和siRNA干扰片段通过脂质体转染的方法分别转染到HEK 293T细胞中,利用实时定量PC... 目的探讨HEK 293T细胞中受体酪氨酸激酶c-MET的表达是否受SNAPIN基因表达的影响。方法构建pEGFPSNAPIN荧光蛋白表达载体,并将pEGFP-SNAPIN荧光蛋白表达载体和siRNA干扰片段通过脂质体转染的方法分别转染到HEK 293T细胞中,利用实时定量PCR的方法在转录水平上观察SNAPIN表达改变对其相互作用蛋白c-MET的影响。结果成功构建pEGFP-SNAPIN荧光蛋白表达载体;实时定量PCR实验结果显示SNAPIN被沉默后其表达量降低,c-MET的表达也相应下降;转染pEGFP-SNAPIN荧光蛋白表达载体后,SNAPIN的表达量增加,c-MET的表达也相应增加。结论转录水平上SNAPIN相互作用蛋白c-MET的表达可能受到SNAPIN的调控。 展开更多
关键词 SNAPIN C-MET hek 293t细胞
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血小板膜受体糖蛋白Ib-IX-V复合物在瞬时转染的HEK293T细胞中的异常表达
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作者 刘兰波 莫茜 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期1200-1206,共7页
血小板膜受体糖蛋白(glycoprotein,GP)Ib-IX-V复合物在血小板活化过程中起到关键作用,因此其结构及功能一直是研究的热点和难点。由于血小板缺乏细胞核,研究者通常需将野生型或突变型的GPIb-IX-V基因转染至其他哺乳动物细胞系中(如CHO、... 血小板膜受体糖蛋白(glycoprotein,GP)Ib-IX-V复合物在血小板活化过程中起到关键作用,因此其结构及功能一直是研究的热点和难点。由于血小板缺乏细胞核,研究者通常需将野生型或突变型的GPIb-IX-V基因转染至其他哺乳动物细胞系中(如CHO、HEK 293T等)以研究其结构与功能,因此GPIb-IX-V复合物在这些细胞系中是否能如实的反映其在血小板中的情况,是决定这些细胞系是否适合GPIb-IX-V复合物研究的关键。本研究通过检测GPIb-IX-V复合物在不同细胞系中的表达情况,明确细胞系差异是否可能干扰复合物的表达,进而找出研究GPIb-IX-V复合物的最适细胞系。在不同种属、不同组织来源的常用细胞系(如CHO、HEK 293T、HeLa等)中单独或共转染GPIb-IX-V复合物的亚基,并用流式细胞术检测GPIb-IX-V复合物在膜表面的表达量。结果发现:CHO细胞在瞬时转染与稳定转染后GPV在细胞膜表面表达依赖于其与GPIb-IX复合物的相互作用,与血小板中的情况一致。相反,在HEK 293T细胞系中,尽管GPIb-IX复合物的表达情况与CHO细胞及血小板中一致,但是GPV在细胞膜表面的表达不再依赖于GPIb-IX复合物;进一步在HeLa、MES13及HUVEC细胞系中的研究发现,GPV可以在HeLa及MES13细胞膜上独立表达,但是在HUVEC细胞表面不表达,提示GPIb-IX-V复合物各亚基之间的依赖性(进而表现为膜表面的表达量)在不同的细胞系中有所不同。结论:本研究为今后对于GPIb-IX-V复合物的研究具有一定的指导意义,尤其是在细胞系的选择上。HEK 293T细胞系极可能对研究结果造成偏倚,因而并非研究GPIb-IX-V复合物尤其是GPV亚基的最佳选择。 展开更多
关键词 血小板膜受体 GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ复合物 hek-293t细胞 CHO细胞
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小鼠精子发生相关蛋白3基因在小鼠生精细胞的特异表达及对HEK 293T细胞凋亡和自噬的影响 被引量:3
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作者 王玉晶 温丽敏 +3 位作者 白欣艳 曹睿 王海龙 郭睿 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期41-48,共8页
目的检测小鼠精子发生相关蛋白3(spata3)基因在小鼠生精细胞的表达情况,并借助过表达细胞模型进一步分析该基因对人胚肾HEK 293T细胞凋亡及自噬的影响,旨在探讨spata3在精子发生过程中的意义。方法分别采用RT-PCR和免疫印迹法检测spata... 目的检测小鼠精子发生相关蛋白3(spata3)基因在小鼠生精细胞的表达情况,并借助过表达细胞模型进一步分析该基因对人胚肾HEK 293T细胞凋亡及自噬的影响,旨在探讨spata3在精子发生过程中的意义。方法分别采用RT-PCR和免疫印迹法检测spata3基因mRNA及蛋白产物在小鼠各组织中的表达;应用免疫组织化学和免疫荧光染色观察SPATA3蛋白在生精细胞中的定位;借助脂质体将真核表达载体Plv-EGFP-2(a)purospata3瞬时转染HEK 293T细胞,进一步在蛋白水平分析细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)、BAX和Bcl-2及自噬相关蛋白LC3A/B的变化。结果 Spata3基因及其编码产物在小鼠睾丸组织特异表达;粗线期精母细胞和圆形精子细胞的胞质与胞核均有显著SPATA3蛋白的阳性着色,长形精子细胞的胞质也有大量分布;过表达spata3的HEK 293T细胞内活化型Caspase-3和PARP降解产物的含量较对照组差异无显著性,BAX表达量0.815±0.020较裸细胞组0.469±0.012和空载体转染组0.588±0.018均有所增高,Bcl-2含量0.214±0.020低于裸细胞0.507±0.021和空载体转染组0.545±0.024,LC3A/B-Ⅱ的表达量0.741±0.037则显著高于裸细胞组0.136±0.011和空载体转染组0.169±0.012。结论 Spata3基因在小鼠生精细胞特异表达,过表达spata3对HEK 293T细胞凋亡无明显影响,但可以促进细胞自噬。 展开更多
关键词 精子发生相关蛋白3基因 hek 293t细胞 细胞转染 自噬 免疫印迹法 小鼠
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SHP-2在三氧化二砷诱导HEK293T细胞凋亡中的作用 被引量:3
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作者 司云凤 祝晓春 +7 位作者 孙东升 齐琦 王果元 金成艳 王丽娜 徐长庆 田野 张力 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期1086-1089,共4页
目的探讨蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2在三氧化二砷(As2O3)诱导HEK293T细胞凋亡中的作用。方法将pIRES-GFP空载体、pIRES-GFP-SHP-2野生型和pIRES-GFP-SHP-2C459S突变体载体通过磷酸钙方法转染HEK293T细胞;在5μmol.L-1的As2O3孵育48 h后,用... 目的探讨蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2在三氧化二砷(As2O3)诱导HEK293T细胞凋亡中的作用。方法将pIRES-GFP空载体、pIRES-GFP-SHP-2野生型和pIRES-GFP-SHP-2C459S突变体载体通过磷酸钙方法转染HEK293T细胞;在5μmol.L-1的As2O3孵育48 h后,用流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot方法检测Cyt-C、Caspase-3、p-ERK、ERK、p-JNK及JNK的表达变化。结果5μmol.L-1As2O3可诱导HEK293T细胞凋亡,SHP-2能抑制其作用;SHP-2C459S突变体组Cyt-C和Caspase-3表达均高于空载体组,SHP-2野生型组则低于空载体组;SHP-2野生型组p-ERK表达高于空载体组,SHP-2C459S突变体组则相反;p-JNK的表达,SHP-2C459S突变体组高于空载体组,而SHP-2野生型组低于空载体组。结论SHP-2可抑制As2O3诱导的HEK293T细胞凋亡,其机制可能与激活ERK和抑制JNK途径有关。 展开更多
关键词 蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2 三氧化二砷 细胞凋亡 ERK JNK hek293t细胞 细胞信号转导
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白藜芦醇对镉诱导HEK 293T细胞自噬与凋亡的影响 被引量:2
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作者 王芸芸 刘小綪 +3 位作者 邵峦峦 杨颖 蒋琦辰 毛伟平 《复旦学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期52-60,共9页
为了探究白藜芦醇与镉诱导人胚胎肾细胞293(HEK 293T)细胞自噬与凋亡之间的关系,本研究在已证明低浓度镉诱导细胞自噬,高浓度镉导致细胞凋亡的基础上,以HEK 293T细胞为研究对象,并分别与镉、白藜芦醇及各种抑制剂进行联合培养,利用免疫... 为了探究白藜芦醇与镉诱导人胚胎肾细胞293(HEK 293T)细胞自噬与凋亡之间的关系,本研究在已证明低浓度镉诱导细胞自噬,高浓度镉导致细胞凋亡的基础上,以HEK 293T细胞为研究对象,并分别与镉、白藜芦醇及各种抑制剂进行联合培养,利用免疫印记分析检测自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ、溶酶体标志蛋白cathepsin L、组蛋白去乙酰化酶相关蛋白SIRT1和凋亡蛋白caspase-3的表达水平,激光共聚焦检测细胞自噬质粒(GFP-LC3)和溶酶体相关膜蛋白结合因子(LAMP2)的表达量,同时检测活性氧(ROS)水平,倒置相差显微镜和流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果显示:白藜芦醇进一步增强镉诱导HEK 293T细胞的自噬,且这种效应发生在自噬体溶酶体融合之前,其作用原理可能与白藜芦醇的抗氧化性有关并与SIRT1基因有密切联系,以上结果说明白藜芦醇对镉诱导的细胞自噬有一定的调控作用,此外,细胞凋亡与自噬之间关系紧密,白藜芦醇可抑制镉诱导的细胞凋亡。 展开更多
关键词 白藜芦醇 hek 293t细胞 自噬 细胞凋亡
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稳定表达TRPA1通道的HEK-293T细胞模型的建立 被引量:2
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作者 黄娟 明露 +3 位作者 陈艳芬 唐春萍 张玉英 杨超燕 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期440-443,共4页
目的建立稳定表达TRPA1的HEK-293T细胞模型,并鉴定模型构建是否成功。方法构建TRPA1真核表达质粒,采用脂质体转染法将其转入HEK-293T细胞中,经G418筛选稳定表达株,采用RT-PCR、免疫组化技术,检测HEK-293T细胞TRPA1基因的转录和蛋白的表... 目的建立稳定表达TRPA1的HEK-293T细胞模型,并鉴定模型构建是否成功。方法构建TRPA1真核表达质粒,采用脂质体转染法将其转入HEK-293T细胞中,经G418筛选稳定表达株,采用RT-PCR、免疫组化技术,检测HEK-293T细胞TRPA1基因的转录和蛋白的表达。结果经酶切、测序证明,TRPA1基因的真核重组表达质粒已成功构建;PCR、免疫组化检测结果表明,将此重组质粒转入HEK-293T细胞可稳定表达TRPA1基因。结论成功构建了能稳定表达TRPA1通道的HEK-293T细胞株,为体外研究TRPA1生理病理功能和筛选相关TRPA1通道调节剂奠定了基础。 展开更多
关键词 TRPA1通道 克隆 hek-293t细胞 脂质体转染 真核质粒 细胞模型
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垂盆草乙醇提取物诱导HEK 293T细胞凋亡及作用机制 被引量:3
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作者 彭勇波 王齐 梁大焱 《中南民族大学学报(自然科学版)》 CAS 2019年第3期372-376,共5页
目的:探讨垂盆草乙醇提取物(EESS)对HEK293T细胞凋亡的诱导作用和机制.方法:利用CCK-8法检测垂盆草乙醇提取物对细胞增殖影响,用Hoechst33342染色法及Annexin V-FITC染色流式细胞检测其对细胞凋亡的影响,以Western blot检测其对NF-κB... 目的:探讨垂盆草乙醇提取物(EESS)对HEK293T细胞凋亡的诱导作用和机制.方法:利用CCK-8法检测垂盆草乙醇提取物对细胞增殖影响,用Hoechst33342染色法及Annexin V-FITC染色流式细胞检测其对细胞凋亡的影响,以Western blot检测其对NF-κB信号通路蛋白及凋亡相关通路蛋白Bcl-2,Bax,Bcl-xL等表达的影响.结果:EESS对细胞增殖具有抑制作用,能促进其凋亡呈剂量依赖性,并显著上调NF-κΒ磷酸化水平及凋亡启动蛋白线粒体细胞色素C(Cyc)蛋白和促凋亡蛋白Bax的表达(P<0.05).结论:垂盆草乙醇提取物能诱导HEK 293T细胞的凋亡,其作用机制与NF-κΒ信号途径及其介导的凋亡启动蛋白Cyt c和促凋亡蛋白Bax的表达上调有关. 展开更多
关键词 垂盆草 乙醇提取物 hek293t 凋亡
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HEK-293T细胞敲除TRIM25基因促进脑心肌炎病毒复制的研究
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作者 刘文文 吕林 +3 位作者 朱慧欣 延君芳 姜平 白娟 《畜牧与兽医》 北大核心 2022年第6期78-84,共7页
为了探究三方基序蛋白25(TRIM25)对脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)增殖的影响,在HEK-293T细胞上使用簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除TRIM25基因,并通过PCR测序和Western blot确认敲除效果,... 为了探究三方基序蛋白25(TRIM25)对脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)增殖的影响,在HEK-293T细胞上使用簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除TRIM25基因,并通过PCR测序和Western blot确认敲除效果,然后观察敲除细胞形态并利用试剂盒测定TRIM25缺失后细胞增殖速度的变化,确认敲除细胞与野生细胞无明显差异,用EMCV感染敲除细胞后,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、病毒滴定测定和Western blot等方法测定病毒基因转录水平、蛋白表达情况。结果显示:感染EMCV后,敲除细胞与野生细胞相比,显著促进了病毒的转录水平、病毒蛋白的翻译水平和子代病毒的毒力(P<0.05)。综上,在HEK-293T细胞上,成功构建TRIM25缺失细胞系,且试验表明TRIM25的缺失有助于EMCV的复制。研究结果为后续TRIM25抗病毒机制研究提供了理论依据。 展开更多
关键词 TRIM25基因 基因敲除 hek-293t细胞 脑心肌炎病毒
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人SMAD4全长及剪接体在HEK-293T细胞中的亚细胞定位及转录活性分析
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作者 方晋仁 尹小慧 +3 位作者 周涛 李国庆 秦辉 杨南扬 《生命科学研究》 CAS CSCD 2021年第2期95-101,共7页
为了观察人SMAD4全长及剪接体在HEK-293T中的亚细胞定位,并分析它们在HEK-293T细胞中的转录活性差异,将SMAD4全长及剪接体的pEGFP-C1重组质粒转染至HEK-293T细胞中,在荧光显微镜下观察含GFP标签的SMAD4全长及其剪接体蛋白的亚细胞定位,... 为了观察人SMAD4全长及剪接体在HEK-293T中的亚细胞定位,并分析它们在HEK-293T细胞中的转录活性差异,将SMAD4全长及剪接体的pEGFP-C1重组质粒转染至HEK-293T细胞中,在荧光显微镜下观察含GFP标签的SMAD4全长及其剪接体蛋白的亚细胞定位,并通过双荧光素报告酶实验在HEK-293T细胞中对SMAD4全长及其剪接体激活SBE报告基因的情况进行比较。亚细胞定位观察显示,与pEGFP-C1空载组中GFP在HEK-293T中呈现核质均匀分布不同,GFP-SMAD4和GFP-SMAD4△4、GFP-SMAD4△6、GFP-SMAD4△5-6、GFP-SMAD4△4-6、GFP-SMAD4△4-7五种剪接体均分布于HEK-293T的细胞质中;而GFP-SMAD4△3则主要分布于HEK-293T的细胞核中。双荧光素酶实验结果显示,与空载组相比,在6种剪接体过表达组中,只有SMAD4△3过表达组能对SBE报告基因的荧光素酶活性起到一定的上调作用;但与SMAD4△3过表达组比较,SMAD4全长过表达组能对SBE报告基因的荧光素酶活性起到更明显的上调作用。本文观察了人SMAD4全长及剪接体在HEK-293T中的亚细胞定位,并分析了其对下游信号通路的转录激活情况,可为后续SMAD4剪接体蛋白的功能研究提供一定的基础。 展开更多
关键词 SMAD4 选择性剪接 绿色荧光蛋白(GFP) hek-293t细胞 亚细胞定位 转录活性
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高表达H2型人类组织血型抗原HEK-293T细胞系的构建及其应用
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作者 秦海艳 谢忆 +6 位作者 张巧玲 马素娟 李晨 杨林鹏 付艳丽 李奇蒙 杨俊杰 《微生物学免疫学进展》 CAS 2024年第4期9-15,共7页
目的通过在人胚肾-293T(human embryo kidney-293T,HEK-293T)细胞中过表达岩藻糖转移酶2(fucosyltransferases 2,FUT2)基因,进而催化诺如病毒受体人类组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)的形成,构建介导诺如病毒和受体发生... 目的通过在人胚肾-293T(human embryo kidney-293T,HEK-293T)细胞中过表达岩藻糖转移酶2(fucosyltransferases 2,FUT2)基因,进而催化诺如病毒受体人类组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)的形成,构建介导诺如病毒和受体发生相互作用的细胞系。方法构建FUT2慢病毒质粒,采用Lipofectamine 2000将FUT2慢病毒质粒及pMD.2G和psPAX2包装质粒共转染HEK-293T细胞,收获慢病毒颗粒。慢病毒颗粒感染对数生长期的HEK-293T细胞,嘌呤霉素加压筛选获得HEK-293T/FUT2细胞系。PCR鉴定FUT2基因是否整合到基因组中,RT-qPCR检测HEK-293T/FUT2细胞FUT2 mRNA转录水平,流式细胞术分析HEK-293T/FUT2细胞HBGAs的表达,间接免疫荧光法分析HEK-293T/FUT2细胞与诺如病毒病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的结合活性。结果成功构建了序列正确的慢病毒质粒PLVX-IRES-Puro-FUT2,并获得了慢病毒颗粒。慢病毒颗粒感染HEK-293T细胞后,通过嘌呤霉素加压筛选获得了HEK-293T/FUT2细胞系,PCR验证显示,FUT2基因成功整合到HEK-293T细胞基因组中。HEK-293T/FUT2细胞FUT2 mRNA水平提高了330倍。99.9%的HEK-293T/FUT2细胞表达H2型人类组织血型抗原。GI.1重组诺如病毒VLP可以与HEK-293T/FUT2细胞产生很好的结合反应,EC50为2.007μg/mL。结论建立了H2型人类组织血型抗原稳定高表达的HEK-293T细胞系,并基于该细胞系初步建立了GI.1型重组诺如病毒VLP结合活性评价方法。 展开更多
关键词 人类组织血型抗原 人胚肾293t细胞(hek-293t细胞) 诺如病毒 α-1 2岩藻糖转移酶 结合活性
原文传递
人源GRK2的真核表达、纯化及活性检测 被引量:1
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作者 蒋励萍 陈露颖 +6 位作者 蒯佳婕 王凤玲 李浩 关艳玲 马旸 韩陈陈 魏伟 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2023年第2期179-184,共6页
目的构建人源G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)真核表达系统。方法设计引物,以pIRES-EGFP-GRK2(全长)基因为模板,PCR扩增His-GRK2目的基因,将His-GRK2目的基因连接在pcDNA3.1-EGFP真核表达载体上;将pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2质粒转染至HEK 293T细... 目的构建人源G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)真核表达系统。方法设计引物,以pIRES-EGFP-GRK2(全长)基因为模板,PCR扩增His-GRK2目的基因,将His-GRK2目的基因连接在pcDNA3.1-EGFP真核表达载体上;将pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2质粒转染至HEK 293T细胞,48 h后采用Western blot法检测GRK2蛋白表达,通过镍螯合的磁珠法纯化GRK2蛋白,考马斯亮蓝染色和Western blot法检测GRK2蛋白纯化,His pull down检测GRK2蛋白活性。结果双酶切和测序鉴定结果表明,pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2真核表达质粒成功构建;Western blot法检测结果表明,GRK2蛋白的分子量约为80 ku,提示GRK2蛋白在HEK 293T细胞中成功表达(t=6.433,P=0.003);通过镍螯合的磁珠纯化得到GRK2蛋白,His pull down实验结果表明GRK2与前列腺素E2受体4亚型(EP4)结合,提示GRK2蛋白具有生物学活性(t=13.5,P=0.0002)。结论pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2真核表达质粒的序列测序正确,成功构建GRK2重组质粒,GRK2重组质粒在真核细胞HEK 293T的细胞中成功表达且表达的蛋白具有生物学活性。 展开更多
关键词 G蛋白偶联受体激酶2 hek 293t细胞 真核表达 蛋白纯化 活性鉴定
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绵羊PLC-γ1基因真核表达载体的构建及鉴定
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作者 袁利明 陈云蕾 +3 位作者 刘素平 丁林玲 吴兰 赛务加甫 《石河子大学学报(自然科学版)》 CAS 北大核心 2023年第4期441-448,共8页
目的旨在构建携带红色荧光蛋白(RFP)报告基因的绵羊PLC-γ1非融合性真核表达载体。方法在原有PUC57-PLC-γ1克隆载体基础上,对目的片段N端前加入P2A序列和3个连续Flag序列后使用HindⅢ酶和SalⅠ酶双酶切获得P2A-3×Flag-PLC-γ1片段... 目的旨在构建携带红色荧光蛋白(RFP)报告基因的绵羊PLC-γ1非融合性真核表达载体。方法在原有PUC57-PLC-γ1克隆载体基础上,对目的片段N端前加入P2A序列和3个连续Flag序列后使用HindⅢ酶和SalⅠ酶双酶切获得P2A-3×Flag-PLC-γ1片段,将其连接至pDsRed2-C1载体获得重组质粒pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1;然后采用Lip 2000转染试剂将该重组质粒转染至HEK-293T细胞,最后利用荧光显微镜、qRT-PCR、Western blot、免疫共沉淀(IP)和免疫荧光(IF)法鉴定重组质粒pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1的表达及亚细胞定位情况。结果双酶切和测序结果显示质粒pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1构建成功,观察到红色荧光;免疫荧光的亚细胞定位检测出PLC-γ1蛋白在细胞质中表达;qRT-PCR和Western blotting法均能检测出PLC-γ1表达,与对照组有显著性差异(P>0.01);免疫共沉淀也纯化分离出含有Flag标签的PLC-γ1蛋白。结论本研究成功构建绵羊PLC-γ1基因的真核表达载体,在P2A肽作用下实现目的蛋白PLC-γ1与DsRed2的表达,构建的载体可用于研究PLC-γ1在早期胚胎发育中的作用。 展开更多
关键词 P2A肽 PLC-γ1 绵羊 hek-293t细胞 Flag标签
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从江香猪ApoA1基因的克隆及亚细胞定位研究 被引量:6
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作者 赵佳福 段志强 +3 位作者 杨远青 嵇辛勤 王圆圆 孙成娟 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第7期1954-1960,共7页
试验旨在克隆从江香猪载脂蛋白A1(apolipoprotein A1,ApoA1)基因,研究ApoA1基因在真核细胞中的亚细胞定位情况。通过提取从江香猪总RNA,采用RT-PCR、目的基因的连接、转化等方法构建携带有绿色荧光蛋白的pEGFP-C1-ApoA1重组质粒,并经菌... 试验旨在克隆从江香猪载脂蛋白A1(apolipoprotein A1,ApoA1)基因,研究ApoA1基因在真核细胞中的亚细胞定位情况。通过提取从江香猪总RNA,采用RT-PCR、目的基因的连接、转化等方法构建携带有绿色荧光蛋白的pEGFP-C1-ApoA1重组质粒,并经菌落PCR、双酶切及测序鉴定正确后,转染HEK-293T细胞,36h后观察荧光,分析ApoA1蛋白在真核细胞中的亚细胞定位情况。结果表明,从江香猪ApoA1基因与GenBank上公布的野猪序列相比,有6处发生了碱基突变,其中5处为有义突变,分别导致180位氨基酸由丙氨酸变为谷氨酸、185位氨基酸由组氨酸变为谷氨酰胺、186位氨基酸由缬氨酸变为亮氨酰胺、209位氨基酸由天冬氨酸变为甘氨酸;PSORTⅡPrediction和荧光共定位试验结果均表明,ApoA1蛋白的表达主要集中在细胞外基质,约占总表达量的77.8%。本试验成功克隆了从江香猪ApoA1基因CDS区,且ApoA1蛋白的表达主要集中在细胞外基质中,为进一步构建ApoA1基因转基因动物模型、开展ApoA1基因与人类因肥胖引起的相关疾病关系的研究奠定基础。 展开更多
关键词 丛江香猪 ApoA1基因 pEGFP-C1载体 hek-293t细胞 生物信息学分析 亚细胞定位
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HIV-1 vif基因的RNA干扰体外研究 被引量:3
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作者 江雪艳 卢洪洲 +3 位作者 陈秋丽 潘卫 张云智 沈银忠 《复旦学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期32-36,共5页
目的利用RNAi技术对HIV-1 vif基因的转录后水平进行下调,达到抑制vif蛋白表达的目的,为新的抗HIV治疗和预防研究提供理论基础。方法通过体外转录法合成siRNA,与转接有vif基因的表达质粒共同转染HEK293T细胞,荧光显微镜下观察干扰效果,... 目的利用RNAi技术对HIV-1 vif基因的转录后水平进行下调,达到抑制vif蛋白表达的目的,为新的抗HIV治疗和预防研究提供理论基础。方法通过体外转录法合成siRNA,与转接有vif基因的表达质粒共同转染HEK293T细胞,荧光显微镜下观察干扰效果,并利用Real-time PCR和Western blot对HIV-1 vif分别从转录和表达水平进行验证。结果将pEGFP-N1-vif重组载体转染HEK 293T细胞后,结果显示vif蛋白可以在细胞中高水平表达;针对vif设计的3段特异的siRNA可以有效且特异地降低vif蛋白的表达。结论RNAi技术可以下调HIV-1蛋白的表达,此技术可以作为一项新的治疗和预防HIV-1的方法用于进一步的研究。 展开更多
关键词 人类免疫缺陷病毒(HIV) vif基因 vif蛋白 RNAI siRNA 人胚肾293t细胞 pEGFP—N1质粒
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