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稳定表达TRPA1通道的HEK-293T细胞模型的建立 被引量:2
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作者 黄娟 明露 +3 位作者 陈艳芬 唐春萍 张玉英 杨超燕 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期440-443,共4页
目的建立稳定表达TRPA1的HEK-293T细胞模型,并鉴定模型构建是否成功。方法构建TRPA1真核表达质粒,采用脂质体转染法将其转入HEK-293T细胞中,经G418筛选稳定表达株,采用RT-PCR、免疫组化技术,检测HEK-293T细胞TRPA1基因的转录和蛋白的表... 目的建立稳定表达TRPA1的HEK-293T细胞模型,并鉴定模型构建是否成功。方法构建TRPA1真核表达质粒,采用脂质体转染法将其转入HEK-293T细胞中,经G418筛选稳定表达株,采用RT-PCR、免疫组化技术,检测HEK-293T细胞TRPA1基因的转录和蛋白的表达。结果经酶切、测序证明,TRPA1基因的真核重组表达质粒已成功构建;PCR、免疫组化检测结果表明,将此重组质粒转入HEK-293T细胞可稳定表达TRPA1基因。结论成功构建了能稳定表达TRPA1通道的HEK-293T细胞株,为体外研究TRPA1生理病理功能和筛选相关TRPA1通道调节剂奠定了基础。 展开更多
关键词 tRPA1通道 克隆 hek-293t细胞 脂质体转染 真核质粒 细胞模型
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HEK-293T细胞敲除TRIM25基因促进脑心肌炎病毒复制的研究
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作者 刘文文 吕林 +3 位作者 朱慧欣 延君芳 姜平 白娟 《畜牧与兽医》 北大核心 2022年第6期78-84,共7页
为了探究三方基序蛋白25(TRIM25)对脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)增殖的影响,在HEK-293T细胞上使用簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除TRIM25基因,并通过PCR测序和Western blot确认敲除效果,... 为了探究三方基序蛋白25(TRIM25)对脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)增殖的影响,在HEK-293T细胞上使用簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除TRIM25基因,并通过PCR测序和Western blot确认敲除效果,然后观察敲除细胞形态并利用试剂盒测定TRIM25缺失后细胞增殖速度的变化,确认敲除细胞与野生细胞无明显差异,用EMCV感染敲除细胞后,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、病毒滴定测定和Western blot等方法测定病毒基因转录水平、蛋白表达情况。结果显示:感染EMCV后,敲除细胞与野生细胞相比,显著促进了病毒的转录水平、病毒蛋白的翻译水平和子代病毒的毒力(P<0.05)。综上,在HEK-293T细胞上,成功构建TRIM25缺失细胞系,且试验表明TRIM25的缺失有助于EMCV的复制。研究结果为后续TRIM25抗病毒机制研究提供了理论依据。 展开更多
关键词 tRIM25基因 基因敲除 hek-293t细胞 脑心肌炎病毒
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人SMAD4全长及剪接体在HEK-293T细胞中的亚细胞定位及转录活性分析
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作者 方晋仁 尹小慧 +3 位作者 周涛 李国庆 秦辉 杨南扬 《生命科学研究》 CAS CSCD 2021年第2期95-101,共7页
为了观察人SMAD4全长及剪接体在HEK-293T中的亚细胞定位,并分析它们在HEK-293T细胞中的转录活性差异,将SMAD4全长及剪接体的pEGFP-C1重组质粒转染至HEK-293T细胞中,在荧光显微镜下观察含GFP标签的SMAD4全长及其剪接体蛋白的亚细胞定位,... 为了观察人SMAD4全长及剪接体在HEK-293T中的亚细胞定位,并分析它们在HEK-293T细胞中的转录活性差异,将SMAD4全长及剪接体的pEGFP-C1重组质粒转染至HEK-293T细胞中,在荧光显微镜下观察含GFP标签的SMAD4全长及其剪接体蛋白的亚细胞定位,并通过双荧光素报告酶实验在HEK-293T细胞中对SMAD4全长及其剪接体激活SBE报告基因的情况进行比较。亚细胞定位观察显示,与pEGFP-C1空载组中GFP在HEK-293T中呈现核质均匀分布不同,GFP-SMAD4和GFP-SMAD4△4、GFP-SMAD4△6、GFP-SMAD4△5-6、GFP-SMAD4△4-6、GFP-SMAD4△4-7五种剪接体均分布于HEK-293T的细胞质中;而GFP-SMAD4△3则主要分布于HEK-293T的细胞核中。双荧光素酶实验结果显示,与空载组相比,在6种剪接体过表达组中,只有SMAD4△3过表达组能对SBE报告基因的荧光素酶活性起到一定的上调作用;但与SMAD4△3过表达组比较,SMAD4全长过表达组能对SBE报告基因的荧光素酶活性起到更明显的上调作用。本文观察了人SMAD4全长及剪接体在HEK-293T中的亚细胞定位,并分析了其对下游信号通路的转录激活情况,可为后续SMAD4剪接体蛋白的功能研究提供一定的基础。 展开更多
关键词 SMAD4 选择性剪接 绿色荧光蛋白(GFP) hek-293t细胞 亚细胞定位 转录活性
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TALEN质粒转染HEK-293T细胞的条件优化 被引量:3
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作者 严爱芬 刘婉霞 +3 位作者 刘芳 刘靖 张雅洁 唐冬生 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期2554-2559,共6页
本研究探讨了TALEN质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件。以TALEN质粒右臂中的绿色荧光蛋白为报告基因,分别研究转染试剂、质粒DNA的量、转染试剂与质粒DNA的比例对转染效果的影响,转染24 h后荧光显微镜下统计具有代表性视野的绿色荧光... 本研究探讨了TALEN质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件。以TALEN质粒右臂中的绿色荧光蛋白为报告基因,分别研究转染试剂、质粒DNA的量、转染试剂与质粒DNA的比例对转染效果的影响,转染24 h后荧光显微镜下统计具有代表性视野的绿色荧光细胞,计算绿色荧光细胞/总细胞数的比例得出转染率,并利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率。实验结果表明,TALEN质粒转染293T细胞,采用Fugene HD转染试剂比Lipofectamine 2000转染试剂细胞存活率高;以6孔板为例,转染质粒DNA量为4μg时转染效率最高(49.0±8.0)%;Fugene HD与质粒DNA比例(μg/μL)为3:1时转染效率最高。本研究建立TALEN表达质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件,可作为相关研究或应用提供参考。 展开更多
关键词 转染 优化 tALEN hek-293t
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pEGFP-C1-ApoE真核表达载体的构建及在HEK-293T细胞中的表达
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作者 赵佳福 嵇辛勤 +2 位作者 杨远青 段志强 龚婷 《畜牧与兽医》 北大核心 2018年第4期1-6,共6页
载脂蛋白E是决定血浆胆固醇水平的重要遗传因素之一,其作为多种脂蛋白的结构蛋白,在脂类的运输和代谢中起着非常重要的作用。本文以脂肪型小型猪从江香猪为研究对象,通过克隆从江香猪载脂蛋白E(ApoE)基因CDS区,构建携带有绿色荧光蛋白... 载脂蛋白E是决定血浆胆固醇水平的重要遗传因素之一,其作为多种脂蛋白的结构蛋白,在脂类的运输和代谢中起着非常重要的作用。本文以脂肪型小型猪从江香猪为研究对象,通过克隆从江香猪载脂蛋白E(ApoE)基因CDS区,构建携带有绿色荧光蛋白的p EGFP-C1-ApoE重组质粒,转染HEK-293T细胞,旨在研究ApoE基因表达产物在真核细胞中的表达情况。序列比对结果表明,从江香猪ApoE基因与Gen Bank上公布的野猪序列相比,有8处发生了碱基突变,其中7处发生在C和G之间,另一处103位T→C的碱基突变,导致丝氨酸(S)突变为稀有密码子脯氨酸(P),使ApoE基因稀有密码子由23个增加到24个;生物信息学分析发现,突变后从江香猪ApoE基因二级、三级结构,蛋白理化性质均发生了改变。信号肽预测软件发现,ApoE蛋白在1-18位氨基酸残基位具有信号肽。荧光共定位实验结果表明,ApoE蛋白在细胞中表达部位与软件预测结果一致,均在细胞质中表达。相关研究为进一步构建ApoE基因转基因动物模型奠定基础。 展开更多
关键词 从江香猪 载体构建 hek-293t细胞 细胞转染 基因表达
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牛磺胆酸对TGR5介导的HEK-293T和NR8383细胞cAMP的影响
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作者 张子英 李培锋 +2 位作者 史琳凯 刘倩 王彩云 《内蒙古农业大学学报(自然科学版)》 CAS 2015年第1期9-13,共5页
目的:研究牛磺胆酸(Taurocholic Acid,TCA)对瞬转TGR5受体的HEK-293T及NR8383细胞的c AMP含量的影响。方法:采用MTT法测定TCA对细胞毒性范围,采用ELISA法测定TCA对细胞内c AMP含量的影响。结果:TCA对瞬转TGR5受体的HEK-293T细胞产生的c ... 目的:研究牛磺胆酸(Taurocholic Acid,TCA)对瞬转TGR5受体的HEK-293T及NR8383细胞的c AMP含量的影响。方法:采用MTT法测定TCA对细胞毒性范围,采用ELISA法测定TCA对细胞内c AMP含量的影响。结果:TCA对瞬转TGR5受体的HEK-293T细胞产生的c AMP含量呈剂量依赖性增加(P<0.05),TCA对瞬转TGR5受体的NR8383细胞产生的c AMP含量显著增加(P<0.05)。结论:TCA对TGR5介导的两种细胞的c AMP的含量均有显著性提高。 展开更多
关键词 牛磺胆酸 tGR5 hek-293t细胞 NR8383细胞 CAMP
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纳米Eu_2O_3对HEK-293T细胞的生物活性影响 被引量:2
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作者 周雪萍 侯惠智 +2 位作者 李英奇 杨斌盛 杨频 《化学学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2011年第1期106-110,共5页
稀土化合物的生物效应研究已经引起广泛关注.利用激光共聚焦显微镜观察到纳米Eu2O3能进入活HEK-293T细胞中且位于细胞核周围.在体外培养条件下,利用流式细胞仪法检测了纳米Eu2O3对细胞的活力及对细胞周期的影响,结果表明当纳米颗粒浓度... 稀土化合物的生物效应研究已经引起广泛关注.利用激光共聚焦显微镜观察到纳米Eu2O3能进入活HEK-293T细胞中且位于细胞核周围.在体外培养条件下,利用流式细胞仪法检测了纳米Eu2O3对细胞的活力及对细胞周期的影响,结果表明当纳米颗粒浓度小于200μg?mL-1时,对细胞活性没有明显影响;而当纳米颗粒浓度≥400μg?mL-1时,对细胞活性明显抑制.当Eu2O3纳米颗粒在低浓度范围(≤50μg?mL-1)时对细胞周期基本没有影响,而高浓度(≥200μg?mL-1)时对细胞周期均有显著抑制,停滞在DNA合成后期.这些研究结果均表明纳米Eu2O3对HEK-293T细胞具有明显的生物效应. 展开更多
关键词 纳米Eu2O3 hek-293t细胞 生物活性
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再生基因4(REG4)真核表达载体的构建及其蛋白在HEK293T细胞中的表达、纯化
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作者 徐杨 杜惠芬 +4 位作者 李克生 柴丹丹 石晓玲 连晓雯 张学良 《现代检验医学杂志》 CAS 2023年第4期35-39,共5页
目的构建再生基因4(regenerating gene 4,REG4)的真核表达载体,转染人胚肾细胞293T(human embryonic kidney 293T cells,HEK 293T),获得重组人再生胰岛衍生蛋白IV(regenerating islet-derived protein IV,Reg IV)。方法根据NCBI数据库R... 目的构建再生基因4(regenerating gene 4,REG4)的真核表达载体,转染人胚肾细胞293T(human embryonic kidney 293T cells,HEK 293T),获得重组人再生胰岛衍生蛋白IV(regenerating islet-derived protein IV,Reg IV)。方法根据NCBI数据库REG4基因序列进行基因优化、合成,将其克隆至pCDNA3.4载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)将pCDNA3.4-REG4质粒瞬时转染至HEK 293T细胞(实验组),同时以pEGFP-C1质粒作为转染对照组,未转染重组质粒的HEK 293T细胞作为空白对照组。荧光显微镜观察转染对照组转染效率,分别收集实验组及空白对照组细胞和细胞培养液上清,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)与免疫印迹试验(Western-Blot,WB)检测Reg IV蛋白表达水平。通过镍柱及丙烯葡聚糖凝胶S-400(Sephacryl S-400)柱进行蛋白纯化,SDS-PAGE及WB对纯化后重组蛋白进行鉴定。结果经测序和双酶切鉴定,重组质粒pCDNA3.4-REG4构建成功。转染对照组(pEGFP-C1质粒)荧光显微镜观察结果显示转染效率约50%,表明转染成功。WB结果显示仅在实验组(pCDNA3.4-REG4质粒)的细胞中检测到RegIV蛋白。镍柱纯化时目的蛋白无法与镍柱填料有效结合,SephacrylS-400凝胶柱层析纯化获得了此重组蛋白。结论成功构建了REG4基因真核表达载体并在HEK 293T细胞中成功表达,为深入研究Reg IV蛋白的作用机理及开发潜在的抗癌靶向药物奠定了基础。 展开更多
关键词 再生基因4 再生胰岛衍生蛋白Ⅳ 真核表达 人胚肾细胞293t 瞬时转染 蛋白纯化
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HEK 293T细胞中TRAF6多聚泛素化修饰KLF5的方式及其修饰位点的鉴定 被引量:1
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作者 李玉 应帅 +6 位作者 葛文 阮玉婷 吴宁霞 王伟民 张婧 邱文 王迎伟 《南京医科大学学报(自然科学版)》 CAS 北大核心 2023年第4期445-451,共7页
目的:研究人胚肾293T(HEK 293T,简称293T)细胞中外源性肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor⁃associated factor 6,TRAF6)与Krüppel样因子5(Krüppel⁃like factor 5,KLF5)的结合及TRAF6多聚泛素化修饰KLF... 目的:研究人胚肾293T(HEK 293T,简称293T)细胞中外源性肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor⁃associated factor 6,TRAF6)与Krüppel样因子5(Krüppel⁃like factor 5,KLF5)的结合及TRAF6多聚泛素化修饰KLF5的方式和修饰的位点。方法:将构建的Flag⁃TRAF6、HA⁃KLF5、泛素过表达质粒、shTRAF6小干扰质粒和TRAF6 C70A位点突变质粒行不同组合转染293T细胞48 h。用免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)和免疫印迹(immunoblotting,IB)实验检查TRAF6与KLF5的结合以及KLF5 K63或K48多聚泛素化水平。此外,构建KLF5全部赖氨酸突变的质粒,分别与TRAF6质粒共转染293T细胞。用前述IP/IB检测KLF5 K63连接的多聚泛素化修饰,并确定KLF5 K63泛素化修饰的位点。结果:293T细胞中TRAF6能与KLF5结合;TRAF6过表达和基因沉默或TRA6酶活性缺失能相应上调或下调KLF5 K63的多聚泛素化;KLF5被TRAF6 K63多聚泛素化修饰的位点是其第99位和第100位的赖氨酸。结论:TRAF6能与KLF5相互作用,并对KLF5⁃K99和K100进行K63多聚泛素化修饰。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子受体相关因子6 Krüppel样因子5 K63连接的多聚泛素化修饰 HEK 293t细胞
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人源WNT16 HEK 293T稳转细胞株构建、蛋白纯化与活性检测方法研究
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作者 王克芬 陈海迪 +3 位作者 章嘉成 周鑫 邓成 武永康 《四川医学》 CAS 2023年第12期1233-1238,共6页
目的无翅型MMTV整合位点家族成员16(WNT16)是一种重要的信号调节蛋白,参与多种细胞生物学过程的调控。本研究旨在构建稳定转染WNT16基因的HEK 293T细胞株,并利用多聚赖氨酸标签(HIS-Tag)实现高效纯化WNT16蛋白。方法使用TK-PCDH-copGFP-... 目的无翅型MMTV整合位点家族成员16(WNT16)是一种重要的信号调节蛋白,参与多种细胞生物学过程的调控。本研究旨在构建稳定转染WNT16基因的HEK 293T细胞株,并利用多聚赖氨酸标签(HIS-Tag)实现高效纯化WNT16蛋白。方法使用TK-PCDH-copGFP-T2A-Puro载体,将WNT16 CDS-HIS序列通过XbaI和BamHI位点连接载体,构建慢病毒载体质粒;将该质粒与pSPAX2和pMD2.G一起共转染HEK 293T细胞,制备携带WNT16基因的慢病毒;利用慢病毒感染HEK 293T细胞,并通过嘌呤霉素筛选和Western Blot鉴定稳定过表达WNT16的细胞株;利用镍螯合琼脂糖凝胶与HIS标签的高亲和性纯化WNT16蛋白,使用考马斯亮蓝染色和Western Blot法检测纯化效果;用纯化的WNT16蛋白刺激Jurkat细胞,使用Western Blot法检测Jurkat细胞中β-catenin信号通路蛋白的水平,以评估WNT16蛋白的活性。结果成功构建过表达WNT16基因的慢病毒表达载体,并用其感染HEK 293T细胞。经过嘌呤霉素筛选和Western Blot鉴定,我们获得了稳定表达WNT16的HEK 293T细胞株。使用HIS标签成功纯化了WNT16蛋白,并用考马斯亮蓝染色和Western Blot法检测了纯化效果。最后,我们用纯化的WNT16蛋白刺激Jurkat细胞,并用Western Blot法检测了Jurkat细胞中β-catenin信号通路蛋白的水平,WNT16蛋白能够显著增加Jurkat细胞中β-catenin蛋白的表达,表明纯化的WNT16蛋白具有激活WNT/β-catenin通路的生物学活性。结论本研究成功实现了WNT16蛋白的高效表达和纯化,并初步研究了其功能。这为进一步探究WNT16在细胞生物学中的作用提供了重要的实验基础。 展开更多
关键词 WNt16 HEK 293t细胞 过表达 稳转细胞株 纯化 HIS标签
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血小板膜受体糖蛋白Ib-IX-V复合物在瞬时转染的HEK293T细胞中的异常表达
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作者 刘兰波 莫茜 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期1200-1206,共7页
血小板膜受体糖蛋白(glycoprotein,GP)Ib-IX-V复合物在血小板活化过程中起到关键作用,因此其结构及功能一直是研究的热点和难点。由于血小板缺乏细胞核,研究者通常需将野生型或突变型的GPIb-IX-V基因转染至其他哺乳动物细胞系中(如CHO、... 血小板膜受体糖蛋白(glycoprotein,GP)Ib-IX-V复合物在血小板活化过程中起到关键作用,因此其结构及功能一直是研究的热点和难点。由于血小板缺乏细胞核,研究者通常需将野生型或突变型的GPIb-IX-V基因转染至其他哺乳动物细胞系中(如CHO、HEK 293T等)以研究其结构与功能,因此GPIb-IX-V复合物在这些细胞系中是否能如实的反映其在血小板中的情况,是决定这些细胞系是否适合GPIb-IX-V复合物研究的关键。本研究通过检测GPIb-IX-V复合物在不同细胞系中的表达情况,明确细胞系差异是否可能干扰复合物的表达,进而找出研究GPIb-IX-V复合物的最适细胞系。在不同种属、不同组织来源的常用细胞系(如CHO、HEK 293T、HeLa等)中单独或共转染GPIb-IX-V复合物的亚基,并用流式细胞术检测GPIb-IX-V复合物在膜表面的表达量。结果发现:CHO细胞在瞬时转染与稳定转染后GPV在细胞膜表面表达依赖于其与GPIb-IX复合物的相互作用,与血小板中的情况一致。相反,在HEK 293T细胞系中,尽管GPIb-IX复合物的表达情况与CHO细胞及血小板中一致,但是GPV在细胞膜表面的表达不再依赖于GPIb-IX复合物;进一步在HeLa、MES13及HUVEC细胞系中的研究发现,GPV可以在HeLa及MES13细胞膜上独立表达,但是在HUVEC细胞表面不表达,提示GPIb-IX-V复合物各亚基之间的依赖性(进而表现为膜表面的表达量)在不同的细胞系中有所不同。结论:本研究为今后对于GPIb-IX-V复合物的研究具有一定的指导意义,尤其是在细胞系的选择上。HEK 293T细胞系极可能对研究结果造成偏倚,因而并非研究GPIb-IX-V复合物尤其是GPV亚基的最佳选择。 展开更多
关键词 血小板膜受体 GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ复合物 hek-293t细胞 CHO细胞
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犬β防御素-1真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达 被引量:4
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作者 靳慧君 仲飞 +3 位作者 吴凌娟 解民 王微 韩冬梅 《动物学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2008年第5期897-902,共6页
哺乳动物的β-防御素是一类具有广谱抗微生物活性的阳离子小肽。为了克隆和分析犬β防御素-1基因,并建立一套在HEK293T细胞中高效表达犬β防御素-1的方法,本研究采用RT-PCR方法从犬睾丸组织中扩增出犬β防御素-1(cBD-1)的cDNA基因,并将... 哺乳动物的β-防御素是一类具有广谱抗微生物活性的阳离子小肽。为了克隆和分析犬β防御素-1基因,并建立一套在HEK293T细胞中高效表达犬β防御素-1的方法,本研究采用RT-PCR方法从犬睾丸组织中扩增出犬β防御素-1(cBD-1)的cDNA基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建了犬β防御素-1基因的真核表达载体pcDNA3.1A-cBD-1,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:克隆的犬β防御素-1基因序列与已发表序列(GenBank编号:NM-001024641)的同源性为99.7%。表达犬β防御素-1经Western-blot检测,证明构建的犬β防御素-1基因表达载体能够在真核细胞中表达,表达产物能够分泌到细胞外。为进一步研究犬β防御素的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 犬β防御素-1 载体构建 HEK293t细胞 表达
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SNAPIN基因对受体酪氨酸激酶c-MET在HEK 293T细胞中表达的影响
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作者 高迎春 张传领 +3 位作者 牛丽丽 温建勋 程国强 肖瑞 《山西医科大学学报》 CAS 2015年第8期724-728,共5页
目的探讨HEK 293T细胞中受体酪氨酸激酶c-MET的表达是否受SNAPIN基因表达的影响。方法构建pEGFPSNAPIN荧光蛋白表达载体,并将pEGFP-SNAPIN荧光蛋白表达载体和siRNA干扰片段通过脂质体转染的方法分别转染到HEK 293T细胞中,利用实时定量PC... 目的探讨HEK 293T细胞中受体酪氨酸激酶c-MET的表达是否受SNAPIN基因表达的影响。方法构建pEGFPSNAPIN荧光蛋白表达载体,并将pEGFP-SNAPIN荧光蛋白表达载体和siRNA干扰片段通过脂质体转染的方法分别转染到HEK 293T细胞中,利用实时定量PCR的方法在转录水平上观察SNAPIN表达改变对其相互作用蛋白c-MET的影响。结果成功构建pEGFP-SNAPIN荧光蛋白表达载体;实时定量PCR实验结果显示SNAPIN被沉默后其表达量降低,c-MET的表达也相应下降;转染pEGFP-SNAPIN荧光蛋白表达载体后,SNAPIN的表达量增加,c-MET的表达也相应增加。结论转录水平上SNAPIN相互作用蛋白c-MET的表达可能受到SNAPIN的调控。 展开更多
关键词 SNAPIN C-MEt HEK 293t细胞
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SHP-2在三氧化二砷诱导HEK293T细胞凋亡中的作用 被引量:3
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作者 司云凤 祝晓春 +7 位作者 孙东升 齐琦 王果元 金成艳 王丽娜 徐长庆 田野 张力 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期1086-1089,共4页
目的探讨蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2在三氧化二砷(As2O3)诱导HEK293T细胞凋亡中的作用。方法将pIRES-GFP空载体、pIRES-GFP-SHP-2野生型和pIRES-GFP-SHP-2C459S突变体载体通过磷酸钙方法转染HEK293T细胞;在5μmol.L-1的As2O3孵育48 h后,用... 目的探讨蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2在三氧化二砷(As2O3)诱导HEK293T细胞凋亡中的作用。方法将pIRES-GFP空载体、pIRES-GFP-SHP-2野生型和pIRES-GFP-SHP-2C459S突变体载体通过磷酸钙方法转染HEK293T细胞;在5μmol.L-1的As2O3孵育48 h后,用流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot方法检测Cyt-C、Caspase-3、p-ERK、ERK、p-JNK及JNK的表达变化。结果5μmol.L-1As2O3可诱导HEK293T细胞凋亡,SHP-2能抑制其作用;SHP-2C459S突变体组Cyt-C和Caspase-3表达均高于空载体组,SHP-2野生型组则低于空载体组;SHP-2野生型组p-ERK表达高于空载体组,SHP-2C459S突变体组则相反;p-JNK的表达,SHP-2C459S突变体组高于空载体组,而SHP-2野生型组低于空载体组。结论SHP-2可抑制As2O3诱导的HEK293T细胞凋亡,其机制可能与激活ERK和抑制JNK途径有关。 展开更多
关键词 蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2 三氧化二砷 细胞凋亡 ERK JNK HEK293t细胞 细胞信号转导
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小鼠精子发生相关蛋白3基因在小鼠生精细胞的特异表达及对HEK 293T细胞凋亡和自噬的影响 被引量:3
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作者 王玉晶 温丽敏 +3 位作者 白欣艳 曹睿 王海龙 郭睿 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期41-48,共8页
目的检测小鼠精子发生相关蛋白3(spata3)基因在小鼠生精细胞的表达情况,并借助过表达细胞模型进一步分析该基因对人胚肾HEK 293T细胞凋亡及自噬的影响,旨在探讨spata3在精子发生过程中的意义。方法分别采用RT-PCR和免疫印迹法检测spata... 目的检测小鼠精子发生相关蛋白3(spata3)基因在小鼠生精细胞的表达情况,并借助过表达细胞模型进一步分析该基因对人胚肾HEK 293T细胞凋亡及自噬的影响,旨在探讨spata3在精子发生过程中的意义。方法分别采用RT-PCR和免疫印迹法检测spata3基因mRNA及蛋白产物在小鼠各组织中的表达;应用免疫组织化学和免疫荧光染色观察SPATA3蛋白在生精细胞中的定位;借助脂质体将真核表达载体Plv-EGFP-2(a)purospata3瞬时转染HEK 293T细胞,进一步在蛋白水平分析细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)、BAX和Bcl-2及自噬相关蛋白LC3A/B的变化。结果 Spata3基因及其编码产物在小鼠睾丸组织特异表达;粗线期精母细胞和圆形精子细胞的胞质与胞核均有显著SPATA3蛋白的阳性着色,长形精子细胞的胞质也有大量分布;过表达spata3的HEK 293T细胞内活化型Caspase-3和PARP降解产物的含量较对照组差异无显著性,BAX表达量0.815±0.020较裸细胞组0.469±0.012和空载体转染组0.588±0.018均有所增高,Bcl-2含量0.214±0.020低于裸细胞0.507±0.021和空载体转染组0.545±0.024,LC3A/B-Ⅱ的表达量0.741±0.037则显著高于裸细胞组0.136±0.011和空载体转染组0.169±0.012。结论 Spata3基因在小鼠生精细胞特异表达,过表达spata3对HEK 293T细胞凋亡无明显影响,但可以促进细胞自噬。 展开更多
关键词 精子发生相关蛋白3基因 HEK 293t细胞 细胞转染 自噬 免疫印迹法 小鼠
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白藜芦醇对镉诱导HEK 293T细胞自噬与凋亡的影响 被引量:2
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作者 王芸芸 刘小綪 +3 位作者 邵峦峦 杨颖 蒋琦辰 毛伟平 《复旦学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期52-60,共9页
为了探究白藜芦醇与镉诱导人胚胎肾细胞293(HEK 293T)细胞自噬与凋亡之间的关系,本研究在已证明低浓度镉诱导细胞自噬,高浓度镉导致细胞凋亡的基础上,以HEK 293T细胞为研究对象,并分别与镉、白藜芦醇及各种抑制剂进行联合培养,利用免疫... 为了探究白藜芦醇与镉诱导人胚胎肾细胞293(HEK 293T)细胞自噬与凋亡之间的关系,本研究在已证明低浓度镉诱导细胞自噬,高浓度镉导致细胞凋亡的基础上,以HEK 293T细胞为研究对象,并分别与镉、白藜芦醇及各种抑制剂进行联合培养,利用免疫印记分析检测自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ、溶酶体标志蛋白cathepsin L、组蛋白去乙酰化酶相关蛋白SIRT1和凋亡蛋白caspase-3的表达水平,激光共聚焦检测细胞自噬质粒(GFP-LC3)和溶酶体相关膜蛋白结合因子(LAMP2)的表达量,同时检测活性氧(ROS)水平,倒置相差显微镜和流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果显示:白藜芦醇进一步增强镉诱导HEK 293T细胞的自噬,且这种效应发生在自噬体溶酶体融合之前,其作用原理可能与白藜芦醇的抗氧化性有关并与SIRT1基因有密切联系,以上结果说明白藜芦醇对镉诱导的细胞自噬有一定的调控作用,此外,细胞凋亡与自噬之间关系紧密,白藜芦醇可抑制镉诱导的细胞凋亡。 展开更多
关键词 白藜芦醇 HEK 293t细胞 自噬 细胞凋亡
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高表达H2型人类组织血型抗原HEK-293T细胞系的构建及其应用
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作者 秦海艳 谢忆 +6 位作者 张巧玲 马素娟 李晨 杨林鹏 付艳丽 李奇蒙 杨俊杰 《微生物学免疫学进展》 CAS 2024年第4期9-15,共7页
目的通过在人胚肾-293T(human embryo kidney-293T,HEK-293T)细胞中过表达岩藻糖转移酶2(fucosyltransferases 2,FUT2)基因,进而催化诺如病毒受体人类组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)的形成,构建介导诺如病毒和受体发生... 目的通过在人胚肾-293T(human embryo kidney-293T,HEK-293T)细胞中过表达岩藻糖转移酶2(fucosyltransferases 2,FUT2)基因,进而催化诺如病毒受体人类组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)的形成,构建介导诺如病毒和受体发生相互作用的细胞系。方法构建FUT2慢病毒质粒,采用Lipofectamine 2000将FUT2慢病毒质粒及pMD.2G和psPAX2包装质粒共转染HEK-293T细胞,收获慢病毒颗粒。慢病毒颗粒感染对数生长期的HEK-293T细胞,嘌呤霉素加压筛选获得HEK-293T/FUT2细胞系。PCR鉴定FUT2基因是否整合到基因组中,RT-qPCR检测HEK-293T/FUT2细胞FUT2 mRNA转录水平,流式细胞术分析HEK-293T/FUT2细胞HBGAs的表达,间接免疫荧光法分析HEK-293T/FUT2细胞与诺如病毒病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的结合活性。结果成功构建了序列正确的慢病毒质粒PLVX-IRES-Puro-FUT2,并获得了慢病毒颗粒。慢病毒颗粒感染HEK-293T细胞后,通过嘌呤霉素加压筛选获得了HEK-293T/FUT2细胞系,PCR验证显示,FUT2基因成功整合到HEK-293T细胞基因组中。HEK-293T/FUT2细胞FUT2 mRNA水平提高了330倍。99.9%的HEK-293T/FUT2细胞表达H2型人类组织血型抗原。GI.1重组诺如病毒VLP可以与HEK-293T/FUT2细胞产生很好的结合反应,EC50为2.007μg/mL。结论建立了H2型人类组织血型抗原稳定高表达的HEK-293T细胞系,并基于该细胞系初步建立了GI.1型重组诺如病毒VLP结合活性评价方法。 展开更多
关键词 人类组织血型抗原 人胚肾293t细胞(hek-293t细胞) 诺如病毒 α-1 2岩藻糖转移酶 结合活性
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垂盆草乙醇提取物诱导HEK 293T细胞凋亡及作用机制 被引量:3
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作者 彭勇波 王齐 梁大焱 《中南民族大学学报(自然科学版)》 CAS 2019年第3期372-376,共5页
目的:探讨垂盆草乙醇提取物(EESS)对HEK293T细胞凋亡的诱导作用和机制.方法:利用CCK-8法检测垂盆草乙醇提取物对细胞增殖影响,用Hoechst33342染色法及Annexin V-FITC染色流式细胞检测其对细胞凋亡的影响,以Western blot检测其对NF-κB... 目的:探讨垂盆草乙醇提取物(EESS)对HEK293T细胞凋亡的诱导作用和机制.方法:利用CCK-8法检测垂盆草乙醇提取物对细胞增殖影响,用Hoechst33342染色法及Annexin V-FITC染色流式细胞检测其对细胞凋亡的影响,以Western blot检测其对NF-κB信号通路蛋白及凋亡相关通路蛋白Bcl-2,Bax,Bcl-xL等表达的影响.结果:EESS对细胞增殖具有抑制作用,能促进其凋亡呈剂量依赖性,并显著上调NF-κΒ磷酸化水平及凋亡启动蛋白线粒体细胞色素C(Cyc)蛋白和促凋亡蛋白Bax的表达(P<0.05).结论:垂盆草乙醇提取物能诱导HEK 293T细胞的凋亡,其作用机制与NF-κΒ信号途径及其介导的凋亡启动蛋白Cyt c和促凋亡蛋白Bax的表达上调有关. 展开更多
关键词 垂盆草 乙醇提取物 HEK293t 凋亡
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Protective Effect of Reduced Glutathione C_(60) Derivative against Hydrogen Peroxide-induced Apoptosis in HEK 293T Cells 被引量:1
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作者 黄锦 周迟 +3 位作者 贺军 胡铮 官文超 刘胜洪 《Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences)》 SCIE CAS 2016年第3期356-363,共8页
Hydrogen peroxide(H_2O_2) and free radicals cause oxidative stress, which induces cellular injuries, metabolic dysfunction, and even cell death in various clinical abnormalities. Fullerene(C_(60)) is critical fo... Hydrogen peroxide(H_2O_2) and free radicals cause oxidative stress, which induces cellular injuries, metabolic dysfunction, and even cell death in various clinical abnormalities. Fullerene(C_(60)) is critical for scavenging oxygen free radicals originated from cell metabolism, and reduced glutathione(GSH) is another important endogenous antioxidant. In this study, a novel water-soluble reduced glutathione fullerene derivative(C_(60)-GSH) was successfully synthesized, and its beneficial roles in protecting against H_2O_2-induced oxidative stress and apoptosis in cultured HEK 293 T cells were investigated. Fourier Transform infrared spectroscopy and 1H nuclear magnetic resonance were used to confirm the chemical structure of C_(60)-GSH. Our results demonstrated that C_(60)-GSH prevented the reactive oxygen species(ROS)-mediated cell damage. Additionally, C_(60)-GSH pretreatment significantly attenuated H_2O_2-induced superoxide dismutase(SOD) consumption and malondialdehyde(MDA) elevation. Furthermore, C_(60)-GSH inhibited intracellular calcium mobilization, and subsequent cell apoptosis via bcl-2/bax-caspase-3 signaling pathway induced by H_2O_2 stimulation in HEK 293 T cells. Importantly, these protective effects of C_(60)-GSH were superior to those of GSH. In conclusion, these results suggested that C_(60)-GSH has potential to protect against H_2O_2-induced cell apoptosis by scavenging free radicals and maintaining intracellular calcium homeostasis without evident toxicity. 展开更多
关键词 reduced glutathione C60 derivative hydrogen peroxide oxidative stress apoptosis HEK 293t cells
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高良姜含药血清及主要成分对TRPA1信号通路的影响 被引量:3
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作者 李梦秋 黄娟 +5 位作者 邹国发 李坤平 冯毅凡 明露 高振虎 陈艳芬 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第10期1443-1449,共7页
目的体外研究高良姜含药血清及主要成分对TRPA1信号通路的影响。方法以稳定表达TRPA1通道的HEK-293T细胞为体外研究模型,分别采用RT-PCR、Western blot、ELISA、激光共聚焦荧光显微镜研究高良姜含药血清对TRPA1 mRNA和蛋白、细胞内cAMP... 目的体外研究高良姜含药血清及主要成分对TRPA1信号通路的影响。方法以稳定表达TRPA1通道的HEK-293T细胞为体外研究模型,分别采用RT-PCR、Western blot、ELISA、激光共聚焦荧光显微镜研究高良姜含药血清对TRPA1 mRNA和蛋白、细胞内cAMP和Ca^(2+)浓度的影响,并初步确认高良姜3类主要成分对TRPA1表达的影响;采用高效液相色谱法检测高良姜含药血清中的主要有效成分。结果与空白血清组相比,高良姜含药血清对TRPA1 mRNA及蛋白的表达均具有一定的抑制作用,能增加细胞中cAMP含量,降低细胞内Ca^(2+)浓度;黄酮类成分20 mg·L^(-1)与二芳基庚烷类40 mg·L^(-1)对TRPA1 mRNA表达有明显的抑制作用;HPLC结果表明高良姜素和二芳基庚烷是高良姜含药血清的主要入血成分。结论高良姜可以下调TRPA1/Ca^(2+)信号通路,提高细胞内cAMP含量,该作用可能是其温中止痛分子机制的重要基础,主要物质基础是黄酮类和二芳基庚烷成分。 展开更多
关键词 高良姜 含药血清 HPLC 黄酮类 二芳基庚烷类 tRPA1 hek-293t细胞 温中止痛
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