人脑源性神经营养因子重组腺病毒载体的构建、鉴定及其在HEK293A细胞中的表达

目的构建人脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)重组腺病毒真核表达载体,研究其在无BDNF分泌的HEK293A细胞中的表达情况,为临床上治疗创伤性脑损伤提供更多基础方面的研究资料。方法①以供体质粒和pAdEasy-1腺病毒系统作为底物构建人BDNF重组腺病毒真核表达载体并包装病毒,检测滴度;②将含人BDNF基因的腺病毒液(A组,实验组)及未含任何基因片段的空白病毒液(B组,对照组)分别转染HEK293A细胞,同时设立空白组(C组),72 h后通过倒置荧光显微镜观察转染情况;③采用RT-PCR方法检测转染后各组细胞中BDNF基因mRNA表达情况;④采用Western blotting方法检测转染后各组细胞BDNF蛋白表达情况。结果①成功构建人BDNF重组腺病毒真核表达载体,经过包装后病毒滴度为1.74×108pfu/mL;②B、C两组细胞BDNF的mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),而A组细胞BDNF的mRNA表达量明显高于B、C两组,差异有统计学意义(P<0.05);③B、C两组细胞BDNF的蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),A组蛋白表达相对OD值明显高于另外两组,差异有统计学意义P<0.05)。结论人BDNF重组腺病毒载体的成功构建不仅明显提高了BDNF基因在细胞中的表达水平,同时还为其进一步应用于创伤性脑损伤的体内实验研究打下基础。

小鼠甘丙肽1型受体在HEK293A细胞中的表达和内化

目的:克隆小鼠甘丙肽1型受体(mGalR1)基因,构建其真核表达载体,并观察该基因在HEK293A细胞中的表达和内化。方法:应用RT-PCR方法,以小鼠下丘脑RNA为模板,扩增获得甘丙肽I型受体(mGalR1)基因并定向克隆到pEGFP-N1真核表达载体;mGalR1-pEGFP表达载体瞬时转染HEK293A细胞,利用激光共聚焦显微技术观察mGalR1在给予甘丙肽(10-7mol/L)0、5、10、15min刺激时的内化情况。结果:克隆得到正确的mGalR1基因全长序列,其cDNA为1 047bp,共编码348个氨基酸;共聚焦显微镜结果表明mGalR1主要在膜上表达,经甘丙肽刺激5～15min后受体下膜进入胞浆。结论:成功构建真核表达载体mGalR1-pEGFP并在HEK293A中表达;在甘丙肽刺激下小鼠甘丙肽1型受体存在内化现象。