花生红衣中反式白藜芦醇对HEK293T细胞抗氧化的影响

目的:分析花生红衣中的白藜芦醇成分,探究其主要成分反式白藜芦醇(RES)对人胚胎肾细胞293(HEK293T)抗氧化的影响及其潜在的分子机制。方法:采用超声波辅助酶法提取花生红衣中的白藜芦醇,采用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术分析花生红衣中白藜芦醇粗提液的组成成分。通过测定细胞活力,检测RES对HEK293T细胞的最高毒性。通过荧光素酶报告基因试验及免疫印迹试验检测其对Keap1-Nrf2-ARE抗氧化信号通路的影响,以DPPH自由基清除率评价其体外抗氧化能力。结果:HPLC-MS结果表明,花生红衣中含有白藜芦醇苷、白皮杉醇和RES。由于白藜芦醇在自然界中主要以反式白藜芦醇形式存在,因此选择RES进行后续试验。细胞存活力检测结果表明,RES对HEK293T细胞的最高无毒浓度为50μmol/L,体外抗氧化作用呈浓度依赖性。荧光素酶报告基因分析表明,RES显著诱导了ARE介导的转录激活。免疫印迹结果显示,RES能诱导Nrf2介导的3个抗氧化蛋白表达【血红素氧合酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)和谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCLM)】表达。此外,DPPH自由基清除率测定结果表明,RES能有效清除DPPH自由基,具有体外抗氧化能力。结论:花生红衣中白藜芦醇的主要成分RES对HEK293T细胞有抗氧化作用,可通过Keap1-Nrf2-ARE信号通路激活潜在的抗氧化活性。

犬β防御素-1真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达

哺乳动物的β-防御素是一类具有广谱抗微生物活性的阳离子小肽。为了克隆和分析犬β防御素-1基因,并建立一套在HEK293T细胞中高效表达犬β防御素-1的方法,本研究采用RT-PCR方法从犬睾丸组织中扩增出犬β防御素-1(cBD-1)的cDNA基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建了犬β防御素-1基因的真核表达载体pcDNA3.1A-cBD-1,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:克隆的犬β防御素-1基因序列与已发表序列(GenBank编号:NM-001024641)的同源性为99.7%。表达犬β防御素-1经Western-blot检测,证明构建的犬β防御素-1基因表达载体能够在真核细胞中表达,表达产物能够分泌到细胞外。为进一步研究犬β防御素的功能奠定了基础。

一种高效稳定的磷酸钙转染HEK293T细胞的方法

为了克服磷酸钙转染法在真核细胞中转染效率低和不稳定性等缺点,适用于体外在哺乳细胞中高效表达外源蛋白,将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达质粒通过常规的磷酸钙转染法导入到HEK293T细胞中,对影响质粒转染效率的条件逐步予以优化,具体包括:在制备磷酸钙-DNA沉淀复合物时,对DNA质粒的用量和涡旋混匀时间的优化;磷酸钙-DNA沉淀形成后对转染促进剂(甘油、丁酸钠和氯喹)的浓度、作用时间及其组合进行优化和筛选。结果表明:GFP转染6孔板培养的HEK293T细胞的DNA质粒最适用量为3μg/孔,其转染效率较1和2μg/孔的平均转染效率提高了50%,较4和5μg/孔的平均转染效率提高了70%以上;涡旋混匀时间最佳为10s,比涡旋混匀5s时的转染效率提高了80%;在上述优化条件基础上加入不同的转染促进剂,其中单独使用15%甘油处理细胞6.5min时,所得转染效率较2.5、4.5、8.5和10.5min有明显提高,15%甘油+5mmol/L丁酸钠联用或者单独用500μmol/L氯喹处理细胞后,转染效率较常规方法分别提高了80%和75%,且荧光表达强度有所增强。总之,该文通过对磷酸钙转染时和转染后的条件进行优化,使其转染效率较常规方法有了显著提高,相对于脂质体转染法更加安全可靠,且价格低廉,因此可适用于大规模蛋白表达质粒转染或者病毒包装,尤其适用于各种糖基化蛋白如肿瘤诊断标志物在体外的高通量表达与制备。

过表达Grx1抑制HEK293T细胞中H2O2诱导的p38MAPK信号通路

谷氧还蛋白1(glutaredoxin1,Grx1)是细胞内一种重要的巯基-二硫键氧化还原酶,在细胞内氧化还原状态的调控及抵抗氧化应激损伤过程中发挥重要作用.为进一步探讨Grx1的抗氧化机制,本实验将重组质粒pcDNA3.1(+)-hGrx1瞬时转染HEK293T细胞,经RT-PCR和Western印迹验证,细胞转染后实现了Grx1的过表达;以不同浓度H2O2为损伤因素,建立细胞氧化应激模型,检测过表达Grx1后细胞存活率,丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)活力和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率的变化,观察过表达Grx1后细胞的抗氧化能力;用终浓度100μmol/L H2O2作用于细胞,利用Western印迹检测120 min内HEK293T细胞中p38MAPK磷酸化水平.实验结果表明,HEK293T细胞过表达Grx1后,缓解了细胞的氧化应激损伤;转染空载体组细胞p38MAPK磷酸化水平在H2O2刺激后5min开始升高,15min达到最高值,并可维持至120min左右;而过表达Grx1组细胞p38MAPK磷酸化水平在H2O2刺激后各时间段没有明显改变,提示Grx1通过抑制H2O2诱导的p38MAPK信号通路激活发挥其抗氧化作用.

稳定表达绿色荧光蛋白的HEK293T细胞的构建

为探讨绿色荧光蛋白(GFP)在传代细胞中是否能随细胞的增殖稳定表达,构建稳定表达GFP的细胞系统,选取HEK293T细胞,使用第三代慢病毒包装系统,包装表达了GFP的慢病毒,然后用包装好的慢病毒去侵染HEK293T细胞.通过细胞成像技术统计了不同代数细胞的荧光强弱并计算细胞形态大小,利用膜片钳记录了HEK293T细胞的电流-电压(I-V)曲线.实验结果显示,GFP能随细胞的增殖稳定表达,被慢病毒侵染后的细胞的形态及基本电生理活动与正常细胞相比,没有产生显著差异.

重组犬IFN-γ在HEK293T细胞中的表达

为了建立一套犬IFN-γ(cIFN-γ)在HEK293T细胞中表达的方法,用伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激犬脾细胞,通过RT-PCR方法从脾细胞中扩增犬IFN-γ基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建的真核表达载体pcDNA3.1A-cIFN-γ经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:克隆的犬IFN-γcDNA基因与GenBank上发表的序列一致,同源性100%。表达产物经Western-blot方法检测,证明克隆的犬IFN-γ基因能够在HEK293T细胞中进行表达,并且表达产物能够分泌到细胞外。

猪β防御素-2基因在HEK293T细胞中的表达

用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:本试验扩增的pBD-2基因与已发表的序列完全一致。表达产物经Western-blot检测,证明pBD-2能够在真核细胞HEK293T中表达。

重组鸡白细胞介素-7在HEK293T细胞中的表达及其条件分析

为提高重组鸡白细胞介素-7(chIL-7)在真核细胞中的表达水平,本试验分析了影响基因表达的一些因素,包括转染方法、质粒用量、转染时间及表达时间等,对重组chIL-7表达水平的影响,并通过正交试验设计方法确定了利用HEK293T细胞表达重组chIL-7的最适表达条件。结果表明,在T75细胞瓶中,由脂质体介导使用30μg质粒,转染4h,表达48h和由磷酸钙介导使用40μg质粒,转染6h,表达60h可以获得较高的表达效率,表达水平分别为(124±9)和(94.3±8)μg/106个细胞。本结果为进一步研究chIL-7的功能提供有利条件。

人源性抗体在HEK293T细胞中瞬时表达条件的优化

以HEK293T细胞为宿主对抗体基因的转染和表达条件进行优化。以GFP(green fluorescence protein)和人源性抗b FGF抗体1A2为报告基因,考察了3种转染试剂磷酸钙,PEI,FuGene HD的转染效率,确定FuGene HD的转染效率最高后,对DNA∶FuGene HD的比例,加入氯喹的浓度,转染后的孵育时间,最佳的低温培养温度以及加入组蛋白抑制剂的浓度进行了优化。结果显示,FuGene HD的转染效率最高,达到56.7%。当转染的DNA=2μg/4×106细胞时,DNA∶FuGene HD的最佳比例为1∶4(W/V);加入氯喹能够增强FuGene HD的转染效率,最佳浓度为100μmol/L,转染后的最佳孵育时间为6h;低温诱导能够提高293T细胞表达抗体的能力,最佳的温度为33℃;加入组蛋白抑制剂丁酸钠或丙戊酸能够明显提高抗体的表达量,丙戊酸的效果优于丁酸钠。通过对转染试剂,转染方法,培养温度,组蛋白抑制剂的加入等条件进行优化使人源性抗bFGF抗体的表达量从1.5mg/L提高到了15.1mg/L。

GST pulldown技术检测HEK293T细胞Daam1的活性

目的:运用GST pulldown技术建立真核细胞中Daam1活性检测的可靠方法。方法:构建GST-RhoA的原核表达载体,并使其在大肠杆菌BL21菌株中大量表达。用GST pulldown和Western blot技术分别检测HEK293T细胞中活化的Daam1及Daam1蛋白的表达。结果:在成功构建了GST-RhoA的原核表达载体,并使其在原核细胞中大量表达融合蛋白GST-RhoA后,用GST pulldown和Western blot技术证实HEK293T细胞中有活化的Daam1和Daam1总蛋白的表达。结论:本工作所建立的GST pulldown技术可以检测HEK293T细胞中Daam1的活性,从而为进一步深入研究Daam1在真核细胞中的功能提供了技术保障。

HEK293T细胞扩增重组腺病毒研究

目的探讨HEK293T细胞扩增重组腺病毒的可行性。方法重组腺病毒保存液稀释后感染HEK293T细胞,观察细胞病变效应,半数组织培养感染量测定扩增病毒的滴度,通过体外感染心肌细胞,成纤维细胞验证其感染活性。结果HEK293T细胞可以扩增带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒,病毒滴度为5×106PFU/mL,扩增后的腺病毒可以感染体外培养的心肌细胞和成纤维细胞。结论HEK293T细胞可有效扩增带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒。

pB2R-Venus重组真核载体的构建及在HEK293T细胞中的表达

目的构建带有黄色荧光蛋白突变体Venus标签的人缓激肽2型受体(bradykinin receptor 2,B2R)真核表达载体,用于B2R与相关受体及蛋白的相互作用、B2R受体介导的信号转导机制的研究等。方法根据人B2R基因序列设计引物,以质粒pcDNA3.1-B2R为模板,PCR扩增目的基因人B2R。EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切扩增产物及质粒pVenus-N1,经回收、连接、转化,获取重组质粒。对重组质粒进行酶切、测序鉴定。转染重组质粒至HEK293T细胞,荧光显微镜观察受体B2R的细胞定位,蛋白印迹法检测目的蛋白人B2R蛋白的表达。结果 PCR扩增出了1条长度为1176bp的基因片段,测序结果与GenBank(AY275465)相同。荧光显示B2R表达于质膜。Western blot结果显示,实验组蛋白印迹条带与目的蛋白大小相同,为44kDa。结论成功构建了pB2R-Venus重组真核表达载体,瞬时转染成功,获得了转染有重组质粒的HEK293T细胞。成功构建的重组质粒pB2R-Venus可用于后续BRET、FRET等实验研究,有助于B2R介导的信号转导机制的探讨和药物靶点的寻找。

人CD14信号肽介导卵清蛋白在HEK293T细胞的高效表达

本试验将人CD14信号肽序列与卵清蛋白(ovalbumin,OVA)基因融合,旨在提高OVA在非输卵管上皮细胞中的表达。提取鸡输卵管上皮细胞总RNA,经反转录合成的cDNA,再利用修饰的特异性引物,通过PCR从cDNA中分别扩增出5'端与人CD14信号肽序列融合和非融合的OVA基因,并将它们分别插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成表达载体pcDNA-CD14sp-OVA和pcDNA-OVA。经磷酸钙介导,将质粒转染至HEK293T细胞,使其进行表达,用鼠抗OVA单克隆抗体通过免疫印迹(Western blot)法检测OVA表达水平。结果表明:本试验扩增的OVA基因序列与GenBank中的序列(登录号NM_205152)一致,构建的人CD14信号肽序列融合OVA基因的表达载体结构正确。经过在HEK293T细胞的表达,融合人CD14信号肽序列的重组蛋白OVA的表达水平明显得到提高。结果提示,融合人CD14信号肽序列后的重组蛋白OVA在非输卵管上皮细胞中的表达水平明显提高,为OVA基因作为DNA疫苗模式抗原的应用提供了必要的条件。

基于CRISPR/Cas9系统的HEK293T细胞DMD基因第51号外显子的靶向敲除

目的应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,完成HEK293T细胞中DMD基因第51号外显子(exon51)高效的靶向敲除。方法设计靶向人DMD基因exon51 5'端及3'端的sgRNA并克隆至CRISPR/Cas9载体质粒PX459中,转染至HEK293T细胞后,提取基因组DNA并使用Surveyor法检测切割活性;使用目标外显子两端切割活性最高的sgRNA构建PX459-2sgRNA质粒,转染至HEK293T细胞后用PCR及T载体测序检测靶向外显子切除情况。结果50%的HEK293T细胞中DMD基因exon51被定向切除,编辑效率较高。结论建立使用CRISPR/Cas9单质粒敲除人DMD基因exon51的平台,为DMD及其他遗传病的基因治疗研究奠定实验基础。

Ebp1-绿色荧光蛋白融合基因的构建及在HEK293T细胞中的表达

[目的]构建绿色荧光蛋白融合表达Ebp 1基因载体,并检测其在HEK 293 T细胞中的表达.[方法]采用PCR扩增Ebp 1基因,利用其片断和质粒pEGFPC 1的EcoRⅠ及XhoⅠ限制性酶切位点构建融合表达载体pEGFPC 1-Ebp 1,通过脂质体介导将其转染到HEK 293 T细胞中,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白融合基因的表达情况.[结果]成功地构建融合表达载体pEGFPC 1-Ebp 1,将其转染到HEK 293 T细胞后可观察到其中有EGFP表达.

HEK293T细胞中NLRP3炎性小体活化体系的构建

NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎性小体是一种蛋白复合体,在机体抵抗感染以及无菌性炎症中发挥了至关重要的作用。在HEK293T细胞中构建NLRP3炎性小体活化体系有助于研究其活化及调节机制。将质粒NLRP3、凋亡相关点样蛋白(ASC)、胱冬肽酶-1(Caspase-1)以及pro-1β转染至HEK293T细胞中,随后加入尼日利亚菌素(Nigericin),并利用Western blot以及酶联免疫吸附试验(ELISA)测定成熟的IL-1β。试验结果表明:转染了完整NLRP3炎性小体组分的细胞蛋白和上清中均可检测到IL-1β的成熟体,反之,未转染完整组分的细胞蛋白及上清中不能检测到IL-1β成熟体;同时,随着NLRP3转染量的增加,可检测到的IL-1β的成熟体增加。本研究在HEK293T细胞中成功构建了NLRP3炎性小体活化体系,为后续研究奠定了基础。

SHP-2在三氧化二砷诱导HEK293T细胞凋亡中的作用

目的探讨蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2在三氧化二砷(As2O3)诱导HEK293T细胞凋亡中的作用。方法将pIRES-GFP空载体、pIRES-GFP-SHP-2野生型和pIRES-GFP-SHP-2C459S突变体载体通过磷酸钙方法转染HEK293T细胞;在5μmol.L-1的As2O3孵育48 h后,用流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot方法检测Cyt-C、Caspase-3、p-ERK、ERK、p-JNK及JNK的表达变化。结果5μmol.L-1As2O3可诱导HEK293T细胞凋亡,SHP-2能抑制其作用;SHP-2C459S突变体组Cyt-C和Caspase-3表达均高于空载体组,SHP-2野生型组则低于空载体组;SHP-2野生型组p-ERK表达高于空载体组,SHP-2C459S突变体组则相反;p-JNK的表达,SHP-2C459S突变体组高于空载体组,而SHP-2野生型组低于空载体组。结论SHP-2可抑制As2O3诱导的HEK293T细胞凋亡,其机制可能与激活ERK和抑制JNK途径有关。

利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞株

目的利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因常见突变位点——c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T细胞,为后期研究其基因修复提供可靠的细胞模型。方法针对G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点靶向设计4对向导RNA(sgRNA),构建表达Cas9-sgRNA的外源PX458质粒,将其转染至HEK293T细胞内,通过流式细胞术分选表达GFP荧光蛋白的细胞进行培养,利用T7核酸内切酶1(T7E1)酶切验证CRISPR/Cas9的剪切效率,有限稀释法筛选单克隆细胞,测序鉴定并检测G6PD mRNA、蛋白表达和细胞功能的改变。结果成功构建基于G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的Cas9-sgRNA外源PX458质粒,T7E1酶切检测四对sgRNA的编辑效率分别为6.74%、12.36%、12.54%、2.94%。测序鉴定敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的细胞株构建成功,细胞G6PDmRNA、蛋白表达和G6PD酶活性降低,细胞增殖能力下降,维生素K3诱导细胞死亡增加。结论本研究成功构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞模型,为后期研究基因的修复奠定了基础。

过表达Sprouty2分子促进HEK293T细胞增殖与存活

目的构建表达人Sprouty 2(SPRY2)基因的重组表达载体pDC315/hSPRY2,转染人胚肾(HEK)293T细胞表达目的蛋白,初步探讨其对HEK293T细胞增殖与存活的影响。方法构建hSPRY2重组腺病毒表达载体,体外转染HEK293T细胞,以Western blot法检测目的蛋白的表达,以CCK-8法检测SPRY2对HEK293T细胞增殖或去血清条件下细胞存活的影响。结果成功构建重组表达载体pDC315/hSPRY2,在转染的HEK293T细胞中检测到目的蛋白hSPRY2的表达,转染pDC315/hSPRY2组HEK293T细胞的增殖率及存活率均明显高于对照组即转染pDC315/EGFP组(P<0.05)。结论成功构建了hSPRY2重组表达载体,过表达hSPRY2可促进HEK293T细胞的增殖与存活。

基于SYNJ2BP敲除的HEK293T细胞系研究SYNJ2BP对EIAV复制的影响

为分析突触小泡磷酸酶2结合蛋白(SYNJ2BP)对马传染性贫血病毒(EIAV)复制的影响,本研究设计了2条靶向SYNJ2BP基因外显子的特异性sgRNA,将sgRNA插入plenti-CRISPRv2GFP载体获得重组质粒pSYNsgRNA1和pSYN-sgRNA2,将这2个重组质粒转染HEK293T细胞,通过流式细胞仪分选获得单克隆细胞株,测序结果显示SYNJ2BP基因产生插入突变,经western blot确认已敲除SYNJ2BP基因并稳定遗传,表明获得了SYNJ2BP敲除的HEK293T细胞系。将EIAV感染性克隆质粒CMV3-8分别转染SYNJ2BP敲除的HEK293T细胞系与野生型细胞,经western blot证实与野生型细胞相比敲除SYNJ2BP抑制了EIAV囊膜蛋白的表达,灰度值显示囊膜蛋白表达量降低50%。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了SYNJ2BP敲除的HEK293T细胞系,并发现SYNJ2BP基因敲除后抑制了EIAV囊膜蛋白的表达,本研究为进一步分析SYNJ2BP调节EIAV复制的分子机制提供了参考依据。