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花生红衣中反式白藜芦醇对HEK293T细胞抗氧化的影响
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作者 孙畅 周春田 +5 位作者 岳玉兰 吕呈蔚 李云飞 黄威 李铁柱 胡济美 《中国食品学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第5期150-160,共11页
目的:分析花生红衣中的白藜芦醇成分,探究其主要成分反式白藜芦醇(RES)对人胚胎肾细胞293(HEK293T)抗氧化的影响及其潜在的分子机制。方法:采用超声波辅助酶法提取花生红衣中的白藜芦醇,采用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术分析花... 目的:分析花生红衣中的白藜芦醇成分,探究其主要成分反式白藜芦醇(RES)对人胚胎肾细胞293(HEK293T)抗氧化的影响及其潜在的分子机制。方法:采用超声波辅助酶法提取花生红衣中的白藜芦醇,采用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术分析花生红衣中白藜芦醇粗提液的组成成分。通过测定细胞活力,检测RES对HEK293T细胞的最高毒性。通过荧光素酶报告基因试验及免疫印迹试验检测其对Keap1-Nrf2-ARE抗氧化信号通路的影响,以DPPH自由基清除率评价其体外抗氧化能力。结果:HPLC-MS结果表明,花生红衣中含有白藜芦醇苷、白皮杉醇和RES。由于白藜芦醇在自然界中主要以反式白藜芦醇形式存在,因此选择RES进行后续试验。细胞存活力检测结果表明,RES对HEK293T细胞的最高无毒浓度为50μmol/L,体外抗氧化作用呈浓度依赖性。荧光素酶报告基因分析表明,RES显著诱导了ARE介导的转录激活。免疫印迹结果显示,RES能诱导Nrf2介导的3个抗氧化蛋白表达【血红素氧合酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)和谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCLM)】表达。此外,DPPH自由基清除率测定结果表明,RES能有效清除DPPH自由基,具有体外抗氧化能力。结论:花生红衣中白藜芦醇的主要成分RES对HEK293T细胞有抗氧化作用,可通过Keap1-Nrf2-ARE信号通路激活潜在的抗氧化活性。 展开更多
关键词 花生红衣 白藜芦醇 hek293t 高效液相色谱-质谱联用 Keap1-Nrf2-ARE信号通路 抗氧化
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Cellular Oxidative Damage of HEK293T Cells Induced by Combination of CdCl_2 and Nano-TiO_2 被引量:1
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作者 夏彬 陈建伟 周宜开 《Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences)》 SCIE CAS 2011年第3期290-294,共5页
This study investigated the conjoined cellular oxidative damage of human embryo kidney 293T(HEK293T) cells induced by cadmium chloride(CdCl2) and nanometer titanium dioxide(nano-TiO2).RT-PCR technique was used t... This study investigated the conjoined cellular oxidative damage of human embryo kidney 293T(HEK293T) cells induced by cadmium chloride(CdCl2) and nanometer titanium dioxide(nano-TiO2).RT-PCR technique was used to detect the expressions of Heme oxygenase-1(HO-1) and 8-oxoguanine DNA glycosylase(OGG1).The activities of superoxide dismutase(SOD) and catalase enzyme(CAT) and concentrations of reactive oxygen species(ROS) and maldondialdehyde(MDA) were measured by different approaches.The results showed that CdCl2 and nano-TiO2 at a low concen-tration of 0.75 total toxic unit(TU) exerted an additive effects on HO-1 gene expression,CAT activities and MDA concentrations.When the total TU was increased to 1 or 1.25 TU,the interaction was syner-getic.Moreover,the mixture with high proportion of CdCl2 produced an additive effect on the OGG1 gene expression,and the interaction was changed to be synergetic when the concentration of CdCl2 was lower than or equal to that of nano-TiO2.Synergetic effects of CdCl2 and nano-TiO2 on cellular oxida-tive damage of HEK293T cells were found as indicated by the changes in the SOD activities and ROS concentrations.It was concluded that CdCl2 and nano-TiO2 exerts synergistic effects on the cellular oxidative damage of HEK293T cells,and the sensitivity of these indicators of oxidative damage varies with the proportion of CdCl2 and nano-TiO2 in the mixture. 展开更多
关键词 cadmium chloride NANO-TIO2 oxidative damage hek293t cells
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表达SFTSV Gn基因的重组5型腺病毒的构建与鉴定
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作者 张璇 王新宇 +4 位作者 刘宇婷 涂影叶 梁耀文 易昌华 殷国平 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第9期8-12,17,共6页
为了构建出表达新布尼亚病毒(SFTSV)Gn基因的重组5型腺病毒,试验根据GenBank上发表的SFTSV Gn基因序列(登录号为ADZ04482.1)设计合成引物,采用特异性PCR方法在Gn基因前添加了KOZAK序列和tPA信号肽序列;然后通过酶切、连接等方法构建重... 为了构建出表达新布尼亚病毒(SFTSV)Gn基因的重组5型腺病毒,试验根据GenBank上发表的SFTSV Gn基因序列(登录号为ADZ04482.1)设计合成引物,采用特异性PCR方法在Gn基因前添加了KOZAK序列和tPA信号肽序列;然后通过酶切、连接等方法构建重组穿梭质粒PGA-KOZAK-tPA-Gn,与腺病毒骨架质粒pAd5-ΔE1ΔE3-5E4在BJ5183感受态细胞中进行同源重组,得到重组腺病毒质粒rAd5-KOZAK-tPA-Gn,用PacⅠ酶酶切重组腺病毒质粒,并将线性化的质粒转染至HEK 293细胞中进行病毒包装、扩繁和纯化;采用PCR扩增、Western-blot等技术检测病毒基因的表达情况,并测定重组腺病毒效价。结果表明:通过PCR扩增获得了1 546 bp的KOZAK-tPA-Gn基因,并成功构建了重组穿梭质粒;SFTSV Gn基因在重组腺病毒传代过程中稳定存在;重组腺病毒在HEK 293细胞中表达出分子量约为61 ku的SFTSV Gn蛋白;测得重组腺病毒效价为1×10^(-7.63)/0.1 mL TCID_(50)。说明试验成功构建出表达SFTSV Gn基因的重组5型腺病毒。 展开更多
关键词 新布尼亚病毒 Gn基因 重组5型腺病毒 质粒构建 HEK 293细胞
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犬β防御素-1真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达 被引量:4
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作者 靳慧君 仲飞 +3 位作者 吴凌娟 解民 王微 韩冬梅 《动物学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2008年第5期897-902,共6页
哺乳动物的β-防御素是一类具有广谱抗微生物活性的阳离子小肽。为了克隆和分析犬β防御素-1基因,并建立一套在HEK293T细胞中高效表达犬β防御素-1的方法,本研究采用RT-PCR方法从犬睾丸组织中扩增出犬β防御素-1(cBD-1)的cDNA基因,并将... 哺乳动物的β-防御素是一类具有广谱抗微生物活性的阳离子小肽。为了克隆和分析犬β防御素-1基因,并建立一套在HEK293T细胞中高效表达犬β防御素-1的方法,本研究采用RT-PCR方法从犬睾丸组织中扩增出犬β防御素-1(cBD-1)的cDNA基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建了犬β防御素-1基因的真核表达载体pcDNA3.1A-cBD-1,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:克隆的犬β防御素-1基因序列与已发表序列(GenBank编号:NM-001024641)的同源性为99.7%。表达犬β防御素-1经Western-blot检测,证明构建的犬β防御素-1基因表达载体能够在真核细胞中表达,表达产物能够分泌到细胞外。为进一步研究犬β防御素的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 犬β防御素-1 载体构建 hek293t细胞 表达
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一种高效稳定的磷酸钙转染HEK293T细胞的方法 被引量:4
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作者 况野 房有荣 +6 位作者 刘丽 王蓉 严子琴 李海龙 孟凡国 盛清 欧文斌 《浙江大学学报(农业与生命科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期407-413,共7页
为了克服磷酸钙转染法在真核细胞中转染效率低和不稳定性等缺点,适用于体外在哺乳细胞中高效表达外源蛋白,将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达质粒通过常规的磷酸钙转染法导入到HEK293T细胞中,对影响质粒转染效率的条... 为了克服磷酸钙转染法在真核细胞中转染效率低和不稳定性等缺点,适用于体外在哺乳细胞中高效表达外源蛋白,将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达质粒通过常规的磷酸钙转染法导入到HEK293T细胞中,对影响质粒转染效率的条件逐步予以优化,具体包括:在制备磷酸钙-DNA沉淀复合物时,对DNA质粒的用量和涡旋混匀时间的优化;磷酸钙-DNA沉淀形成后对转染促进剂(甘油、丁酸钠和氯喹)的浓度、作用时间及其组合进行优化和筛选。结果表明:GFP转染6孔板培养的HEK293T细胞的DNA质粒最适用量为3μg/孔,其转染效率较1和2μg/孔的平均转染效率提高了50%,较4和5μg/孔的平均转染效率提高了70%以上;涡旋混匀时间最佳为10s,比涡旋混匀5s时的转染效率提高了80%;在上述优化条件基础上加入不同的转染促进剂,其中单独使用15%甘油处理细胞6.5min时,所得转染效率较2.5、4.5、8.5和10.5min有明显提高,15%甘油+5mmol/L丁酸钠联用或者单独用500μmol/L氯喹处理细胞后,转染效率较常规方法分别提高了80%和75%,且荧光表达强度有所增强。总之,该文通过对磷酸钙转染时和转染后的条件进行优化,使其转染效率较常规方法有了显著提高,相对于脂质体转染法更加安全可靠,且价格低廉,因此可适用于大规模蛋白表达质粒转染或者病毒包装,尤其适用于各种糖基化蛋白如肿瘤诊断标志物在体外的高通量表达与制备。 展开更多
关键词 磷酸钙转染 hek293t细胞 转染促进剂 甘油 丁酸钠 氯喹
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过表达Grx1抑制HEK293T细胞中H2O2诱导的p38MAPK信号通路 被引量:3
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作者 邹朝霞 李强 +4 位作者 刘莹莹 吴莉芳 张春晶 房绍红 周宏博 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期537-542,共6页
谷氧还蛋白1(glutaredoxin1,Grx1)是细胞内一种重要的巯基-二硫键氧化还原酶,在细胞内氧化还原状态的调控及抵抗氧化应激损伤过程中发挥重要作用.为进一步探讨Grx1的抗氧化机制,本实验将重组质粒pcDNA3.1(+)-hGrx1瞬时转染HEK293T细胞,... 谷氧还蛋白1(glutaredoxin1,Grx1)是细胞内一种重要的巯基-二硫键氧化还原酶,在细胞内氧化还原状态的调控及抵抗氧化应激损伤过程中发挥重要作用.为进一步探讨Grx1的抗氧化机制,本实验将重组质粒pcDNA3.1(+)-hGrx1瞬时转染HEK293T细胞,经RT-PCR和Western印迹验证,细胞转染后实现了Grx1的过表达;以不同浓度H2O2为损伤因素,建立细胞氧化应激模型,检测过表达Grx1后细胞存活率,丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)活力和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率的变化,观察过表达Grx1后细胞的抗氧化能力;用终浓度100μmol/L H2O2作用于细胞,利用Western印迹检测120 min内HEK293T细胞中p38MAPK磷酸化水平.实验结果表明,HEK293T细胞过表达Grx1后,缓解了细胞的氧化应激损伤;转染空载体组细胞p38MAPK磷酸化水平在H2O2刺激后5min开始升高,15min达到最高值,并可维持至120min左右;而过表达Grx1组细胞p38MAPK磷酸化水平在H2O2刺激后各时间段没有明显改变,提示Grx1通过抑制H2O2诱导的p38MAPK信号通路激活发挥其抗氧化作用. 展开更多
关键词 谷氧还蛋白 hek293t细胞 氧化应激 P38MAPK 瞬时转染
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稳定表达绿色荧光蛋白的HEK293T细胞的构建 被引量:3
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作者 阳小飞 余意 +2 位作者 刘孟雪 荣伊 林显光 《中南民族大学学报(自然科学版)》 CAS 北大核心 2017年第2期38-41,共4页
为探讨绿色荧光蛋白(GFP)在传代细胞中是否能随细胞的增殖稳定表达,构建稳定表达GFP的细胞系统,选取HEK293T细胞,使用第三代慢病毒包装系统,包装表达了GFP的慢病毒,然后用包装好的慢病毒去侵染HEK293T细胞.通过细胞成像技术统计了不同... 为探讨绿色荧光蛋白(GFP)在传代细胞中是否能随细胞的增殖稳定表达,构建稳定表达GFP的细胞系统,选取HEK293T细胞,使用第三代慢病毒包装系统,包装表达了GFP的慢病毒,然后用包装好的慢病毒去侵染HEK293T细胞.通过细胞成像技术统计了不同代数细胞的荧光强弱并计算细胞形态大小,利用膜片钳记录了HEK293T细胞的电流-电压(I-V)曲线.实验结果显示,GFP能随细胞的增殖稳定表达,被慢病毒侵染后的细胞的形态及基本电生理活动与正常细胞相比,没有产生显著差异. 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 hek293t细胞 慢病毒
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Tet-On系统中多西环素对MBD1诱导表达的调控研究
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作者 卢茜 袁月 +1 位作者 李丹 张鹏 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期47-52,共6页
【目的】构建甲基结合蛋白1(MBD1)的Tet-On可诱导表达质粒和293T细胞,探讨多西环素(Dox)对MBD1表达的影响,并通过分析细胞中质粒启动子CpG甲基化水平反映MBD1调控机制。【方法】使用MBD1引物扩增293T的MBD1表达序列,将其连接于Tet-On诱... 【目的】构建甲基结合蛋白1(MBD1)的Tet-On可诱导表达质粒和293T细胞,探讨多西环素(Dox)对MBD1表达的影响,并通过分析细胞中质粒启动子CpG甲基化水平反映MBD1调控机制。【方法】使用MBD1引物扩增293T的MBD1表达序列,将其连接于Tet-On诱导表达质粒的多克隆位点;将构建成功的质粒用电转染的方法转入MBD1 KO 293T,使用荧光显微镜及Western blot验证获得的MBD1恢复的293T(MBD1 RE 293T);使用不同浓度Dox诱导MBD1表达,利用Western blot检测单克隆细胞中MBD1的表达情况;使用同一浓度Dox诱导MBD1表达,在12、24、48、96、144、192 h收集细胞,利用Western blot检测细胞中MBD1的表达情况;使用亚硫酸氢盐测序方法检测Dox诱导后细胞内可诱导质粒启动子CpG甲基化情况。【结果】成功构建Tet-On诱导表达MBD1质粒;与未诱导细胞相比,Dox诱导后转染细胞MBD1蛋白重新表达;随着Dox浓度的升高细胞中MBD1的表达逐渐增多;相同浓度Dox诱导后,从12-96 h细胞内MBD1的表达逐渐升高,但144 h后MBD1表达下降;细胞内质粒启动子CpG甲基化检测显示,与96 h相比,144和192 h质粒启动子甲基化水平逐渐升高;在诱导144 h加入甲基转移酶抑制剂地西他滨(decitabine)后,质粒启动子甲基化水平降低,MBD1表达升高。【结论】Tet-On可诱导细胞中重新表达MBD1蛋白,并且表达量与Dox浓度正相关,但长时间诱导后细胞内质粒CpG甲基化水平升高,影响细胞中MBD1的表达。 展开更多
关键词 TET-ON MBD1 MBD1ΔCXXC3 甲基化 hek293t
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Downregulation of Serum PTEN Expression in Mercury-Exposed Population and PI3K/AKT Pathway-Induced Inflammation 被引量:1
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作者 MEI Peng DING En Min +6 位作者 YIN Hao Yang DING Xue Xue WANG Huan WANG Jian Feng HAN Lei ZHANG Heng Dong ZHU Bao Li 《Biomedical and Environmental Sciences》 SCIE CAS CSCD 2024年第4期354-366,共13页
Objective This study investigated the impact of occupational mercury(Hg) exposure on human gene transcription and expression, and its potential biological mechanisms.Methods Differentially expressed genes related to H... Objective This study investigated the impact of occupational mercury(Hg) exposure on human gene transcription and expression, and its potential biological mechanisms.Methods Differentially expressed genes related to Hg exposure were identified and validated using gene expression microarray analysis and extended validation. Hg-exposed cell models and PTEN lowexpression models were established in vitro using 293T cells. PTEN gene expression was assessed using qRT-PCR, and Western blotting was used to measure PTEN, AKT, and PI3K protein levels. IL-6 expression was determined by ELISA.Results Combined findings from gene expression microarray analysis, bioinformatics, and population expansion validation indicated significant downregulation of the PTEN gene in the high-concentration Hg exposure group. In the Hg-exposed cell model(25 and 10 μmol/L), a significant decrease in PTEN expression was observed, accompanied by a significant increase in PI3K, AKT, and IL-6 expression.Similarly, a low-expression cell model demonstrated that PTEN gene knockdown led to a significant decrease in PTEN protein expression and a substantial increase in PI3K, AKT, and IL-6 levels.Conclusion This is the first study to report that Hg exposure downregulates the PTEN gene, activates the PI3K/AKT regulatory pathway, and increases the expression of inflammatory factors, ultimately resulting in kidney inflammation. 展开更多
关键词 PTEN Occupational mercury exposure Occupational health PI3K/AKT pathway 293T cell IL-6
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重组鸡白细胞介素-7在HEK293T细胞中的表达及其条件分析 被引量:1
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作者 霍珊珊 王利月 +5 位作者 张永红 张建楼 徐建 崔丹 仲飞 李秀锦 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期83-87,共5页
为提高重组鸡白细胞介素-7(chIL-7)在真核细胞中的表达水平,本试验分析了影响基因表达的一些因素,包括转染方法、质粒用量、转染时间及表达时间等,对重组chIL-7表达水平的影响,并通过正交试验设计方法确定了利用HEK293T细胞表达重组chI... 为提高重组鸡白细胞介素-7(chIL-7)在真核细胞中的表达水平,本试验分析了影响基因表达的一些因素,包括转染方法、质粒用量、转染时间及表达时间等,对重组chIL-7表达水平的影响,并通过正交试验设计方法确定了利用HEK293T细胞表达重组chIL-7的最适表达条件。结果表明,在T75细胞瓶中,由脂质体介导使用30μg质粒,转染4h,表达48h和由磷酸钙介导使用40μg质粒,转染6h,表达60h可以获得较高的表达效率,表达水平分别为(124±9)和(94.3±8)μg/106个细胞。本结果为进一步研究chIL-7的功能提供有利条件。 展开更多
关键词 ChIL-7 最适表达条件 正交试验 hek293t细胞
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重组犬IFN-γ在HEK293T细胞中的表达 被引量:1
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作者 靳慧君 李楠 +3 位作者 郭常春 韩冬梅 王微 仲飞 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期102-105,共4页
为了建立一套犬IFN-γ(cIFN-γ)在HEK293T细胞中表达的方法,用伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激犬脾细胞,通过RT-PCR方法从脾细胞中扩增犬IFN-γ基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建的真核表达载体pcDNA3.1A-cIFN-γ经磷酸钙介导转染HEK293T... 为了建立一套犬IFN-γ(cIFN-γ)在HEK293T细胞中表达的方法,用伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激犬脾细胞,通过RT-PCR方法从脾细胞中扩增犬IFN-γ基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建的真核表达载体pcDNA3.1A-cIFN-γ经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:克隆的犬IFN-γcDNA基因与GenBank上发表的序列一致,同源性100%。表达产物经Western-blot方法检测,证明克隆的犬IFN-γ基因能够在HEK293T细胞中进行表达,并且表达产物能够分泌到细胞外。 展开更多
关键词 犬γ-干扰素 hek293t细胞 表达
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猪β防御素-2基因在HEK293T细胞中的表达 被引量:1
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作者 王微 解民 +3 位作者 吴凌娟 靳慧君 韩冬梅 仲飞 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期78-81,共4页
用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T... 用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:本试验扩增的pBD-2基因与已发表的序列完全一致。表达产物经Western-blot检测,证明pBD-2能够在真核细胞HEK293T中表达。 展开更多
关键词 猪β防御素-2 hek293t细胞 表达
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人源性抗体在HEK293T细胞中瞬时表达条件的优化 被引量:1
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作者 陶俊 向军俭 +2 位作者 王宏 龚义平 邓宁 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第11期137-141,共5页
以HEK293T细胞为宿主对抗体基因的转染和表达条件进行优化。以GFP(green fluorescence protein)和人源性抗b FGF抗体1A2为报告基因,考察了3种转染试剂磷酸钙,PEI,FuGene HD的转染效率,确定FuGene HD的转染效率最高后,对DNA∶FuGene HD... 以HEK293T细胞为宿主对抗体基因的转染和表达条件进行优化。以GFP(green fluorescence protein)和人源性抗b FGF抗体1A2为报告基因,考察了3种转染试剂磷酸钙,PEI,FuGene HD的转染效率,确定FuGene HD的转染效率最高后,对DNA∶FuGene HD的比例,加入氯喹的浓度,转染后的孵育时间,最佳的低温培养温度以及加入组蛋白抑制剂的浓度进行了优化。结果显示,FuGene HD的转染效率最高,达到56.7%。当转染的DNA=2μg/4×106细胞时,DNA∶FuGene HD的最佳比例为1∶4(W/V);加入氯喹能够增强FuGene HD的转染效率,最佳浓度为100μmol/L,转染后的最佳孵育时间为6h;低温诱导能够提高293T细胞表达抗体的能力,最佳的温度为33℃;加入组蛋白抑制剂丁酸钠或丙戊酸能够明显提高抗体的表达量,丙戊酸的效果优于丁酸钠。通过对转染试剂,转染方法,培养温度,组蛋白抑制剂的加入等条件进行优化使人源性抗bFGF抗体的表达量从1.5mg/L提高到了15.1mg/L。 展开更多
关键词 人源性抗体 瞬时表达 优化 hek293t
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GST pulldown技术检测HEK293T细胞Daam1的活性 被引量:1
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作者 李卫星 杜军 朱一超 《南京医科大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期1412-1416,共5页
目的:运用GST pulldown技术建立真核细胞中Daam1活性检测的可靠方法。方法:构建GST-RhoA的原核表达载体,并使其在大肠杆菌BL21菌株中大量表达。用GST pulldown和Western blot技术分别检测HEK293T细胞中活化的Daam1及Daam1蛋白的表达。结... 目的:运用GST pulldown技术建立真核细胞中Daam1活性检测的可靠方法。方法:构建GST-RhoA的原核表达载体,并使其在大肠杆菌BL21菌株中大量表达。用GST pulldown和Western blot技术分别检测HEK293T细胞中活化的Daam1及Daam1蛋白的表达。结果:在成功构建了GST-RhoA的原核表达载体,并使其在原核细胞中大量表达融合蛋白GST-RhoA后,用GST pulldown和Western blot技术证实HEK293T细胞中有活化的Daam1和Daam1总蛋白的表达。结论:本工作所建立的GST pulldown技术可以检测HEK293T细胞中Daam1的活性,从而为进一步深入研究Daam1在真核细胞中的功能提供了技术保障。 展开更多
关键词 GST pulldown hek293t Daam1 真核细胞
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HEK293T细胞扩增重组腺病毒研究 被引量:3
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作者 曹洁玮 李小鹰 《军医进修学院学报》 CAS 2009年第6期860-862,共3页
目的探讨HEK293T细胞扩增重组腺病毒的可行性。方法重组腺病毒保存液稀释后感染HEK293T细胞,观察细胞病变效应,半数组织培养感染量测定扩增病毒的滴度,通过体外感染心肌细胞,成纤维细胞验证其感染活性。结果HEK293T细胞可以扩增带有绿... 目的探讨HEK293T细胞扩增重组腺病毒的可行性。方法重组腺病毒保存液稀释后感染HEK293T细胞,观察细胞病变效应,半数组织培养感染量测定扩增病毒的滴度,通过体外感染心肌细胞,成纤维细胞验证其感染活性。结果HEK293T细胞可以扩增带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒,病毒滴度为5×106PFU/mL,扩增后的腺病毒可以感染体外培养的心肌细胞和成纤维细胞。结论HEK293T细胞可有效扩增带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒。 展开更多
关键词 重组腺病毒 hek293t细胞 绿色荧光蛋白质
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手动膜片钳检测盐酸罗哌卡因及其右旋异构体对HEK293细胞hERG电流的影响 被引量:1
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作者 王静文 徐代月 +1 位作者 陈华 尹利辉 《中国药物警戒》 2024年第4期391-396,共6页
目的研究比较盐酸罗哌卡因和盐酸罗哌卡因右旋异构体对高表达hERG钾通道的HEK293细胞hERG电流的影响。方法用手动膜片钳检测转染后hERG钾通道稳定表达的HEK293细胞电流,多菲莱德做阳性药,将盐酸罗哌卡因和盐酸罗哌卡因右旋异构体依次稀... 目的研究比较盐酸罗哌卡因和盐酸罗哌卡因右旋异构体对高表达hERG钾通道的HEK293细胞hERG电流的影响。方法用手动膜片钳检测转染后hERG钾通道稳定表达的HEK293细胞电流,多菲莱德做阳性药,将盐酸罗哌卡因和盐酸罗哌卡因右旋异构体依次稀释成30.00、10.00、3.33、1.11、0.37μmol·L^(-1),依次作用于细胞,记录电流变化,计算抑制率。结果盐酸罗哌卡因0.37、1.11、3.33、10、30μmol·L^(-1)对电流Iherg-tail的抑制率分别为(6.12±0.30)%、(13.04±1.20)%、(19.21±0.33)%、(35.56±0.66)%、(65.37±4.17)%,IC_(50)为19.482μmol·L^(-1)(n=15)。盐酸罗哌卡因右旋异构体0.37、1.11、3.33、10.00、30.00μmol·L^(-1)对电流Iherg-tail的抑制率分别为(4.13±3.43)%、(7.34±5.60)%、(9.49±2.75)%、(16.60±0.87)%、(31.36±1.45)%,IC_(50)>30μmol·L^(-1)(n=15)。阳性对照药品多菲莱德0.00185、0.00556、0.01667、0.05000、0.15000μmol·L^(-1)对电流Iherg-tail的抑制率分别为(7.81±2.77)%、(19.67±1.88)%、(57.16±4.39)%、(89.71±3.55)%、(99.66±0.89)%、IC_(50)为0.015μmol·L^(-1)(n=15)。结论和阳性对照药品多菲莱德比较,盐酸罗哌卡因对hERG通道为弱抑制作用,盐酸罗哌卡因右旋异构体对hERG通道为无明显抑制作用。 展开更多
关键词 盐酸罗哌卡因 盐酸罗哌卡因右旋异构体 酰胺类局麻药 手动膜片钳 HEK293细胞 HERG钾通道 立体选择性
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pB2R-Venus重组真核载体的构建及在HEK293T细胞中的表达 被引量:1
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作者 季丙元 程葆华 +2 位作者 王春梅 陈京 白波 《济宁医学院学报》 2014年第5期309-312,共4页
目的构建带有黄色荧光蛋白突变体Venus标签的人缓激肽2型受体(bradykinin receptor 2,B2R)真核表达载体,用于B2R与相关受体及蛋白的相互作用、B2R受体介导的信号转导机制的研究等。方法根据人B2R基因序列设计引物,以质粒pcDNA3.1-B2R为... 目的构建带有黄色荧光蛋白突变体Venus标签的人缓激肽2型受体(bradykinin receptor 2,B2R)真核表达载体,用于B2R与相关受体及蛋白的相互作用、B2R受体介导的信号转导机制的研究等。方法根据人B2R基因序列设计引物,以质粒pcDNA3.1-B2R为模板,PCR扩增目的基因人B2R。EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切扩增产物及质粒pVenus-N1,经回收、连接、转化,获取重组质粒。对重组质粒进行酶切、测序鉴定。转染重组质粒至HEK293T细胞,荧光显微镜观察受体B2R的细胞定位,蛋白印迹法检测目的蛋白人B2R蛋白的表达。结果 PCR扩增出了1条长度为1176bp的基因片段,测序结果与GenBank(AY275465)相同。荧光显示B2R表达于质膜。Western blot结果显示,实验组蛋白印迹条带与目的蛋白大小相同,为44kDa。结论成功构建了pB2R-Venus重组真核表达载体,瞬时转染成功,获得了转染有重组质粒的HEK293T细胞。成功构建的重组质粒pB2R-Venus可用于后续BRET、FRET等实验研究,有助于B2R介导的信号转导机制的探讨和药物靶点的寻找。 展开更多
关键词 真核表达载体 hek293t细胞
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人CD14信号肽介导卵清蛋白在HEK293T细胞的高效表达
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作者 能昌爱 李秀锦 +5 位作者 仲飞 李振 张峰 陈慧慧 张考 韩冬梅 《动物营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期2165-2171,共7页
本试验将人CD14信号肽序列与卵清蛋白(ovalbumin,OVA)基因融合,旨在提高OVA在非输卵管上皮细胞中的表达。提取鸡输卵管上皮细胞总RNA,经反转录合成的cDNA,再利用修饰的特异性引物,通过PCR从cDNA中分别扩增出5'端与人CD14信号肽序列... 本试验将人CD14信号肽序列与卵清蛋白(ovalbumin,OVA)基因融合,旨在提高OVA在非输卵管上皮细胞中的表达。提取鸡输卵管上皮细胞总RNA,经反转录合成的cDNA,再利用修饰的特异性引物,通过PCR从cDNA中分别扩增出5'端与人CD14信号肽序列融合和非融合的OVA基因,并将它们分别插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成表达载体pcDNA-CD14sp-OVA和pcDNA-OVA。经磷酸钙介导,将质粒转染至HEK293T细胞,使其进行表达,用鼠抗OVA单克隆抗体通过免疫印迹(Western blot)法检测OVA表达水平。结果表明:本试验扩增的OVA基因序列与GenBank中的序列(登录号NM_205152)一致,构建的人CD14信号肽序列融合OVA基因的表达载体结构正确。经过在HEK293T细胞的表达,融合人CD14信号肽序列的重组蛋白OVA的表达水平明显得到提高。结果提示,融合人CD14信号肽序列后的重组蛋白OVA在非输卵管上皮细胞中的表达水平明显提高,为OVA基因作为DNA疫苗模式抗原的应用提供了必要的条件。 展开更多
关键词 卵清蛋白 人CD14信号肽 重组蛋白表达 hek293t细胞
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基于CRISPR/Cas9系统的HEK293T细胞DMD基因第51号外显子的靶向敲除
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作者 李双 马珊珊 +4 位作者 崔思颖 屈素真 蔡奥捷 关方霞 孔祥东 《基础医学与临床》 CSCD 2018年第3期375-380,共6页
目的应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,完成HEK293T细胞中DMD基因第51号外显子(exon51)高效的靶向敲除。方法设计靶向人DMD基因exon51 5'端及3'端的sgRNA并克隆至CRISPR/Cas9载体质粒PX459中,转染至HEK293T细胞后,提取基因组DNA并使... 目的应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,完成HEK293T细胞中DMD基因第51号外显子(exon51)高效的靶向敲除。方法设计靶向人DMD基因exon51 5'端及3'端的sgRNA并克隆至CRISPR/Cas9载体质粒PX459中,转染至HEK293T细胞后,提取基因组DNA并使用Surveyor法检测切割活性;使用目标外显子两端切割活性最高的sgRNA构建PX459-2sgRNA质粒,转染至HEK293T细胞后用PCR及T载体测序检测靶向外显子切除情况。结果50%的HEK293T细胞中DMD基因exon51被定向切除,编辑效率较高。结论建立使用CRISPR/Cas9单质粒敲除人DMD基因exon51的平台,为DMD及其他遗传病的基因治疗研究奠定实验基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 DMD基因 单载体质粒 hek293t细胞 外显子敲除
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Ebp1-绿色荧光蛋白融合基因的构建及在HEK293T细胞中的表达
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作者 许东元 金政 《延边大学医学学报》 CAS 2005年第4期235-237,共3页
[目的]构建绿色荧光蛋白融合表达Ebp 1基因载体,并检测其在HEK 293 T细胞中的表达.[方法]采用PCR扩增Ebp 1基因,利用其片断和质粒pEGFPC 1的EcoRⅠ及XhoⅠ限制性酶切位点构建融合表达载体pEGFPC 1-Ebp 1,通过脂质体介导将其转染到HEK 29... [目的]构建绿色荧光蛋白融合表达Ebp 1基因载体,并检测其在HEK 293 T细胞中的表达.[方法]采用PCR扩增Ebp 1基因,利用其片断和质粒pEGFPC 1的EcoRⅠ及XhoⅠ限制性酶切位点构建融合表达载体pEGFPC 1-Ebp 1,通过脂质体介导将其转染到HEK 293 T细胞中,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白融合基因的表达情况.[结果]成功地构建融合表达载体pEGFPC 1-Ebp 1,将其转染到HEK 293 T细胞后可观察到其中有EGFP表达. 展开更多
关键词 EBP 1-绿色荧光蛋白融合基因 hek293t细胞 基因表达 聚合酶链反应 荧光抗体技术 乳腺癌 前列腺癌
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