三种ELISA法检测HFRSV抗原的比较

本文报告了BA-ELISA、夹心法ELISA和抗体捕获法ELISA对五株肾综合征出血热病毒(HFRSV)细胞培养物和感染乳鼠脑中病毒抗原的检测情况,结果表明BA-EL ISA敏感性最高,对HFRSV细胞培养物的检测滴度平均达1:576～2304,对感染乳鼠脑研磨液上清平均达1:2000～11200。由于三种方法均采用了HFRS单克隆抗体,因此非特异反应显著降低,敏感性得以提高。文中对三种ELISA方法的优缺点进行了讨论。

从革螨、恙螨单层细胞中分离和检出HFRSV基因的研究

为探讨HFRSV在螨体组织细胞内的定位 ,采用螨单层细胞培养观察HFRSV。结果发现 :2 4小时后螨单层细胞生长良好 ,15天生长旺盛 ,2 0天有少量细胞病变、脱落 ;15天和2 0天可从贴壁细胞检测出HFRSV。经PCR扩增鉴定 ,革螨和恙螨所携带的HFRSV其抗原性一致。表明革螨。

HFRSV核蛋白pEF-BOS真核表达载体的构建及表达

本文构建了编码肾综合征出血热病毒核蛋白基因的真核表达载体ｐＥＦＢＯＳ／ＨＴＶＮＰ，经限制性酶切及部分序列分析验证其插入正确。采用ＤＥＡＥｄｅｘｔｒａｎ法瞬时转染ＮＩＨ３Ｔ３２４ｈ后，经间接免疫荧光染色证实，ＮＰ基因可在细胞胞浆内高水平表达。

革螨、恙螨体内HFRSV结构蛋白基因检测

用免疫组化法和套式ＰＣＲ 检测革满、恙螨体内ＨＦＲＳＶ结构蛋白（ＭＰ、ＮＰ） 。结果证明革螨、恙螨体内均可检测到ＨＦＲＳＶ 结构蛋白ＭＰ、ＮＰ片段；而恙螨体内ＨＦＲＳＶ 随滴度的增高其检出强度亦增加。该结果从分子生物学上进一步证明革螨、恙螨体内ＨＦＲＳＶ的存在。

一株具有 HFRSV 抗原内影像的抗独特型人单克隆抗体的鉴定

用 Epstein—Barr 病毒转化肾综合征出血热(HFRS)患者恢复期的外周血 B 淋巴母细胞与种间骨髓瘤 SHM—D33细胞融合,经筛选获得一株稳定分泌人源性抗 HFRSV 自身抗独特型(αId)抗体的杂交瘤细胞株 C_(?).通过不同种的抗原特异性抗体的结合试验,抗原竞争抑制试验、抗体阻断抑制试验以及杂交瘤细胞表面α-Id 的检测,均证实了 C_(?)αId 是具有 HFRSV 抗原内影像的 Ab2β。并且在用 Ab2免疫 BABL/c 小鼠和分泌 Ab2的 C_(?)杂交病制备腹水的裸鼠血清中,分别检测到抗 HFRSV 的 Ab3,空斑中和试验证实 Ab3有低滴度病毒中和活性。

应用APAAP光镜技术发现两株HFRSV敏感细胞中HFRSV包涵体

本文应用抗HFRSV McAb的APAAP(碱性磷酸酶—抗碱性磷酸酶)免疫组化技术,首次用光镜在HFRSV感染8—14天的Hep-2和wish细胞中查出病毒包涵体,并且根据其位置和形态特征可分为:(1)中央型包涵体;(2)外周型包涵体;(3)脱落包涵体。上述所见包涵体均在电镜下得到证实。此结果对于了解HFRSV感染细胞后的致病变作用以及研究HFRSV感染细胞包涵体的特征、来源、性质和形成过程具有十分重要的意义。

原位RT-PCR检测革螨体内HFRSV的实验研究

目的 确定肾综合征出血热病毒 (HFRSV)在革螨体内分布和定位 ,进一步证明革螨作为HFRS传播媒介的意义。方法 采用原位RT -PCR分子杂交技术检测鼠肺组织细胞内和革螨体内的HFRSV -RNA。结果 阳性信号呈弥散分布 ,多见于鼠肺吞噬细胞、血管内皮细胞等组织细胞内 ;革螨体内的阳性信号主要分布于卵巢细胞、中肠及支囊上皮细胞中 ,前体组织细胞较少。结论 地高辛素标记的核酸探针原位RT

HFRSV在革螨、恙螨体内生存空间和时间的研究

目的 检测肾综合征出血热病毒 (HFRSV)在革螨、恙螨体内生存空间与时间。方法 采集自然界鼠窝革螨饲养繁殖的子代革螨和鼠体恙螨幼虫、小黑板采集的游离恙螨幼虫及饲养孵化的若虫 ,进行石腊包埋切片 ,接种Vero E6细胞培养 ,应用IFAT检测分别观察HFRSV在螨体内分布和测定不同时期HFRSV的滴度。结果 发现HFRSV多分布于螨体的腹部组织即消化器官 ,前体部分较少 ,个别螨的前足和中足亦可检测到 ;经TCID50 /ml滴度测定以 10 0天为最高 (10 5～ 6)。结论 表明HFRSV在螨体内存在时间较长 ,并可经期传递 ;

HFRSV在平皿表面室温暴露后存活力的定量研究

将肾综合症出血热病毒布于玻璃平皿表面，室温条件下分别暴露０、３０、６０、９０和１２０ｍｉｎ，观察病毒的定量存活情况。结果在经过１２０ｍｉｎ的暴露后，ＨＦＲＳＶ的效价仍高达１０４．２３ＴＣＩＤ５０。这一结果为ＨＦＲＳ的流行病学及其防治研究提供了重要的基础数据。

HFRSV感染NIH裸鼠实验动物研究

目的 研究肾综合症出血热病毒HFRSV感染NIH系裸鼠 ,建立实验动物模型。方法 HFRSV液经腹腔注入NIH裸鼠体内 ,观察其临床表现和病理学变化。结果 实验组小鼠肺、肾、肝、心、脾、脑均有不同程度的淤血、出血及实质细胞变性和坏死性改变 ,无明显中性粒细胞浸润。抗原定位研究发现 ,特异性抗原主要分布于细胞浆内 ,尤其是高尔基器及其附近的囊泡内。结论 HFRSV可致NIH裸鼠发病 ,组织器官血液循环障碍和血管壁通透性增高 ,组织细胞和血管内皮细胞出现损伤。病变表现与人感染HFRSV相似 。

HFRSV在玻璃平皿表面和鼠粪尿中自然衰亡的研究

室温下用第２１代感染肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）的乳小鼠脑悬液滴加于无菌玻璃平皿和盛有鼠粪尿的平皿中，再立即以１６４０细胞培养液反复洗涤后回收，对鼠脑悬液和回收液分别进行ＴＣＩＤ５０测定，计算玻璃平皿表面ＨＦＲＳ病毒的存活情况。结果ＨＦＲＳ病毒在玻璃平皿表面存活率为５３．７９８４％；自然衰亡率为４６．２０１６％。病毒加入鼠粪尿中的存活率为０．００１２％；自然衰亡率为９９．９９８８％。

肾综合征出血热患者对HFRSV抗原免疫应答的研究

本文对47例HFRS患者应用HFRSV抗原再次攻击后观察IgE、嗜酸性粒细胞和临床变化，此外观察HFRSV抗原的皮试反应和皮窗试验细胞渗出情况。结果发现HFRSV抗原注射前后嗜酸粒细胞和血压等无明显变化。抗原注射前IgE正常的13例，注射后7例(53.38％)超出正常范围。皮试结果15分钟阳性14．8％．6小时陌性57．44%，2d～48小时阳性80．89%。皮窗试验淋巴细胞渗出较对照明显升高．此外单核细胞增高例数明显高于对照组．抗原蛀有3例嗜酸性粒细胞增高．以上结果说明HFRS患者应用HFRSV抗原再次攻击后可以出现Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型变患反应的免疫应答，但绝大多数为Ⅳ型．本文对以上各型变态反应在HFRS发病中的作用进行了讨论。

抗HFRSV鼠／人嵌合抗体基因的构建

抗ＨＦＲＳＶ鼠／人嵌合抗体基因的构建祝道成，阎岩，汪力亚，徐志凯，尹文，汪美先，姜绍谆，吴兴安，李以莞，张拥辉（第四军医大学微生物学教研室西安７１００３２中国医学科学院肿瘤所病毒室，北京１０００２１）肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）是一种烈性传染病，在全球...

肾综合征出血热病毒(HFRSV)抗独特型抗体免疫调节初探

本文应用一株HFRSV抗独特型抗体(Ab_2)观察其对HFRSV感染BALB/c小鼠脾细胞体外增殖的影响,以及部分淋巴因子在其中的作用,旨在探讨抗独特型抗体对免疫应答的调节机理。从感染HFRSV小鼠脾细胞中分离制备单个核细胞悬液体外培养,加入不同剂量Ab_2,用~3H-TdR掺入法测定脾细胞增殖水平。结果Ab_2可明显抑制感染小鼠脾细胞在体外的增殖,并呈剂量依赖关系及具有独特型特异性。早期加入EL-4细胞上清或rHuIL-2可完全逆转此抑制作用,且具有剂量依赖和时间相关性。EL-4细胞上清含有IL-2和IL-6。对抗独特型抗体产生抑制作用的机制进行了讨论。

原位分子杂交检测厩真厉螨经叮刺传播姬鼠型和家鼠型HFRSV的研究

目的用分子生物学方法进一步证明革螨在传播两型HFRS中的作用。方法将叮刺感染姬鼠型（76—118株）HFRSV乳鼠后第10天厩真厉螨270只和家鼠型（UR株）HFRSV后第10天厩真后螨200余只，分别制成组织悬液接种正常乳鼠，用Dig标记HFRSVCDNA探针原位分子杂交检测接种后第9天鼠肺；将叮刺感染乳鼠后螨在适宜条件下饲养至100天以上，分别叮刺4～5日龄正常乳鼠，于第3天取鼠肺冰冻切片，经Dig标记HFRSVCDNA探针原位分子杂交检测。结果叮刺76一118株病毒感染乳鼠螨悬液接种4只乳鼠，3只阳性，UR株接种6只，全部阳性；76—118株组饲养至132天，UR株组102天的螨叮刺正常乳鼠后，也从鼠肺中检出病毒RNA。结论首次用分子生物学方法证明该螨可通过叮刺获得姬鼠型和家鼠型HFRSV，螨群体不但维持76—118株病毒132天以上、UR株102天以上，而且均能经叮刘传播，说明此螨能作为姬鼠型和家鼠型HFRSV的适宜传播媒介和贮存宿主，这一发现为我国的HFRS疫区保存和演变提供了一定的实验依据，有流行病学意义；原位分子杂交可缩短用敏感动物分离革螨体内HFRSV的时间，可用于革螨等媒介昆虫传HFRSV的实验研究和流行病学调查。

PCR和生物素探针对HFRSV的检测和分型的探讨

分析比较肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）７６／１１８株和Ｒ＿（２２）株的核苷酸序列，根据引物设计原则及检测分型的目的，设计并合成了３对引物。１对引物取于两毒株间的高同源区段，作为共同引物和外引物；另两对引物取于两毒株间的低同源区段，分别作为野鼠型引物、家鼠型引物和内引物。建立了ＤＮＡ聚合酶链反应（ＰＣＲ）和ＮｅｓｔＰＣＲ方法，并用ＮｃｓｔＰＣＲ合成了两种型特异的生物素探针。ＰＣＲ检测７６／１１８、Ａ＿９、陈、Ｒ＿２、Ｒ＿２２５个毒株，用外引物时均扩增出１条约３００ｂｐ的条带；用内引物的野鼠型引物时，除Ｒ＿（２２）株之外，其余４株均扩增出１条约７０ｂｐ的条带。斑点杂交试验证实了ＰＣＲ检测分型的准确性。ＮｅｓｔＰＣＲ和生物素探针斑点杂交试验可以测出１－１０ｂｇ的目的ｃＤＮＡ。

H-2~b和H-2~d单体型小鼠MHCI类分子结合的HFRSV蛋白抗原表位的预测

本文通过对Ｈ－２ｂ和Ｈ－２ｄ单体型小鼠主要组织相容性抗原Ｉ类分子结合抗原肽的分析，建立了一个计算机预测模型，并对肾综合征出血热病毒核蛋白（ＮＰ）及囊膜糖蛋白Ｇ１和Ｇ２可与Ｂａｌｂ／ｃ小鼠（Ｈ－２ｄ）和Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ－２ｂ）小鼠ＭＨＣＩ类分子相结合的抗原表位进行了分析，预测出可分别与Ｈ－２Ｋｂ，Ｈ－２Ｄｂ，Ｈ－２Ｋｄ，Ｈ－２Ｄｄ和Ｈ－２Ｌｄ结合的核蛋白表位，依此各有７，１４，４，０和８个；囊膜糖蛋白Ｇ１＋Ｇ２的表位，依次有１４，１９，２７，２和４４个。

鼠抗HFRSV衣壳蛋白McAb F3株可变区基因的获取及特性分析

培养鼠抗肾综合征出血热病毒衣壳蛋白Ｆ３杂交瘤细胞株，提取总ＲＮＡ，根据鼠源ＩｇＧ抗体基因家族可变区基因碱基序列的特点，设计简并引物，通过逆转录聚合酶链反应，获得抗体轻链可变区和重链可变区基因。分别将其克隆入载体ＰＴ７ＢｌｕｅＴＶｅｃｔｏｒ，选取阳性重组克隆各两个，分别测定了所载重链可变区和轻链可变区基因的碱基序列，比较了不同克隆轻链可变区基因之间和重链可变区基因之间碱基序列的差异；分析了各自的氨基酸框架及其对应蛋白的亲水性。结果显示，两个重链可变区基因碱基序列有４处不同，同源性为９７９％；其中重组克隆ＺＧ３６４５Ｆ所载重链可变区基因有完整的开放阅读框架，对应的蛋白含有丰富的亲水基因，第１１２氨基酸处亲水性最高；另一重组克隆ＺＧ３６４４Ｆ所载重链可变区基因不能通读。两个轻链基因碱基序列有４处不同，同源性为９９１％，重组克隆ＺＧ３６５５Ｆ和ＺＧ３６５７Ｆ所载轻链可变区基因均有完整的开放阅读框架，对应的蛋白均含有丰富的亲水基因，ＺＧ３６５５Ｆ所载基因对应蛋白第６７氨基酸亲水性最高，ＺＧ３６５７Ｆ所载基因对应蛋白第３４氨基酸亲水性最高。

核苷酸序列分析法在测定HFRSV Chen株型别中的初探

作者用PCR方法扩增了HFRSV Chen株M片段3′末端基因,将之克隆入PUC_(18)质粒,测定出该基因片段的核苷酸序列。通过将该序列与已知6株不同型别HFRSV M片段相应部分进行比较,发现Chen株与76-118株同源性最高,而与其它株差别较大,推测两者是同属一个血清型的不同毒株。本文所应用的方法,对HFRSV基因分型研究及分子流行病学调查都有一定意义。

HFRSV内影像型抗独特型人单抗重链可变区基因克隆

利用反转录－ＰＣＲ方法，从分泌肾综合症出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）内影像型抗独特型人单抗杂交瘤细胞系（Ｃ８）中，成功地克隆了抗ＨＦＲＳＶ１ｄ人单抗重链可变区基因，并将此基因重组入Ｍ１３噬菌体ＤＮＡ中，测定了此重链可变区基因全序列。经计算机分析，基因全长共３５１ｂｐ、编码１１７个氨基酸，氨基酸序列同源性分析发现所推得的该单抗ＣＤＲ２区与ＨＦＲＳＶＧ２蛋白Ｃ端有同源区，此区可能具有较强的抗原性。