HIV(1+2)抗体/P24抗原联合法与胶体硒法在临床检测HIV中的应用研究

目的比较第4代酶联免疫吸附测定(ELISA)[HIV(1+2)抗体与P24抗原联合检测]和胶体硒法在临床检测HIV中的特点。方法分别用第4代ELISA检测试剂和胶体硒试剂检测HIV抗体,初筛阳性样本送重庆市疾病预防控制中心进行Western blot确证试验。结果第4代ELISA试剂检测、胶体硒检测及Western blot检测HIV的阳性率分别为0.34%、0.29%及0.27%。第4代ELISA的HIV漏检率(1.3%)低于胶体硒法(4.9%),而其检测HIV的假阳性率(0.03%)高于胶体硒试剂(0.01%)。结论第4代ELISA和胶体硒法联合应用可提高HIV检测的准确性。

HIV-1核心抗原p24基因的表达、纯化及抗原性分析

目的在原核系统中表达全长HIV-1 p24抗原,并对其抗原性进行鉴定。方法利用PCR技术从HIV-1全基因质粒(BH-10)中扩增p24抗原基因,通过酶切消化后连接到表达载体pET22b上,用此连接产物转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导,表达p24抗原。运用双酶切技术、SDS-PAGE电泳检测插入基因片段的正确性,并用W estern B lot(WB)及ELISA法对表达产物的抗原性进行检测。结果PCR产物和构建的重组质粒pET22b-p24经双酶切插入的外源基因片段均为690 bp,与预期p24抗原全基因片段大小一致。纯化蛋白SDS-PAGE电泳,可见1条相对分子量约26×103的外源表达蛋白带,与预期大小一致,未见杂蛋白带。WB结果显示重组蛋白与HIV-1阳性血清呈特异性反应,与健康人血清没有反应。ELISA检测p24抗原灵敏度为93.94%(62/66),特异性为93.33%(28/30)。结论构建了HIV-1 p24表达载体pET22b-p24,并在原核细胞中高效表达,其表达产物具有良好的抗原性,为研制HIV抗体确认试剂奠定了良好的基础。

HIV-1 p24和gp41融合基因表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化

目的用基因重组技术将HIV-1 p24基因以及gp41基因具有抗原线性中和表位的部分重组连接,构建重组质粒,并在大肠埃希菌中高效表达融合蛋白。方法设计带有酶切位点的引物,分别PCR扩增p24和gp41两个基因,将它们分别连接到pMD18-T载体中,测序验证后,挑选出含有目的基因的正确克隆。将p24片段酶切后连接到gp41基因所在的pMD18-T载体中,再将连接后的两个基因酶切,重新连接到pET21a表达载体中。将表达载体转染大肠埃希菌诱导表达,经Western-blot验证表达正确。结果融合蛋白p24-gp41在大肠埃希菌中高效表达。结论融合蛋白p24-gp41可以在pET21a表达载体中高效表达。

HIV-1核心抗原p24基因的表达、纯化及应用研究

目的在原核系统中表达全长HIV-1 p24抗原,对其抗原性进行鉴定,探讨其对HIV早期诊断的价值。方法利用PCR技术从含有HIV-1 gag基因质粒PTM-1中扩增p24蛋白基因,通过酶切消化后连接到表达载体pET28a上,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导,表达p24抗原。通过ELISA和Western blotting(WB)法检测表达产物的免疫反应活性及特异性。结果PCR产物和构建的重组质粒pET28a-p24经双酶切均显示约690 bpDNA片段,与预期p24抗原全基因片段大小一致。SDS-PAGE电泳可见纯化蛋白为1条相对分子量约26×103Mr的外源表达蛋白带,与预期大小一致。ELISA及WB实验证实表达的p24抗原具有较好的活性及特异性。时间分辨荧光免疫双抗体夹心法显示与市售p24抗原线性一致。结论构建了HIV-1 p24/pET28a原核高效表达系统,表达产物与市售的p24抗原具有相似的抗原性。

金纳米探针结合PCR检测HIV-1 p24抗原的研究

目的建立以金纳米探针结合终端PCR技术超灵敏检测HIV-1p24抗原的方法。方法采用单克隆抗体1G12和1D4建立的夹心ELISA法检测合成的HIV-1p24抗原。挑选拟南芥基因组中一段47bp的DNA作为条形码DNA，与5’端修饰巯基的捕获DNA（条形码DNA的互补序列）杂交形成双链DNA。在金纳米粒子表面连接1D4，并与双链DNA通过巯基连接，制成金纳米探针。微孔板上包被1G12，与待检的重组HIV-1p24抗原及金纳米探针夹心结合。将结合的条形码DNA通过加热解离下来作为检测信号，设计并合成引物进行PCR检测及4％凝胶电泳分析，进而鉴定p24抗原的含量，然后与ELISA法灵敏度进行比较。结果采用单克隆抗体1G12和1134建立夹心ELISA法，检测HIV-1p24抗原最低检测限为1000pg／ml，采用相同抗体对建立金纳米探针法，通过PCR凝胶电泳法间接检测HIV-1p24抗原，显示PCR产物电泳条带的强弱与所检测p24抗原含量具有良好的对应关系，最低检测限可达到1pg／ml。结论金纳米探针结合PCR凝胶电泳法可以对HIV-1p24抗原进行检测，与ELISA法比较，其灵敏度可提高3个数量级。

冰毒对HIV-1在巨噬细胞内复制影响的体外实验研究

目的探讨冰毒对人类免疫缺陷病毒-1型(human immunodeficiency virus 1,HIV-1)在巨噬细胞中复制的作用。方法将巨噬细胞按单纯随机分组原则分为:(1)冰毒+多巴胺受体D1阻滞剂(SCH 23390)处理组,(2)冰毒处理组,(3)SCH 23390处理组,(4)病毒对照组。先用浓度为10-5mol/L的SCH 23390预处理(1)、(3)组1 h,再用10-4mol/L的冰毒处理(1)组24 h,同时用10-5mol/L、10-4mol/L及2.5×10-4mol/L的冰毒处理(2)组24 h,然后每组加入等量的HIV-1进行感染,于感染的第4、6、8、10 d取培养上清,用酶联免疫吸附剂测定(enzymelinked immunosorbnent assay,ELISA)检测培养上清的HIV-1 p24抗原,比较各组之间抗原表达量差异。结果 HIV-1感染巨噬细胞第4、6、8、10 d,病毒对照组的p24抗原表达量均低于3个不同浓度冰毒处理组(均有P<0.01);且各浓度冰毒处理组的p24抗原表达量比对照组增加的倍数,随着感染时间的延长而具有上升的趋势,时间-效应差异有统计学意义(F=155.94,P<0.001);而冰毒+SCH 23390处理组、SCH 23390处理组分别与病毒对照组HIV-1p24抗原表达比较,差异均无统计学意义(均有P>0.05)。结论冰毒能够促进HIV-1在巨噬细胞内的复制,并随感染时间的延长呈递增趋势;冰毒促进HIV-1复制的作用可被多巴胺受体D1阻滞剂(SCH 23390)阻断。

土贝母苷甲在体外对人免疫缺陷病毒核心蛋白p24的产生和细胞病变的作用(英文)

土贝母苷甲是首先在中国从土贝母中分离出的一种三萜皂苷,本文研究了它对人免疫缺陷病毒核心蛋白p24的产生和人免疫缺陷病毒介导的细胞病变的影响。结果表明土贝母苷甲既抑制p24的产生,也抑制细胞病变,其中位有效浓度(EC_(50)分别为24.1和22.9 μg·ml^(-1),土贝母苷甲也有效地中和另外2种分离株(HTLⅤ-Ⅲ_(RF)和HTLⅤ-Ⅲ_(MN)的感染,因此,土贝母苷甲可能是一种有希望的治疗艾滋病的药物。

吗啡对HIV-1在MT2细胞和巨噬细胞中复制的影响

目的 附测定双抗体夹心法检测p24抗原表达.用Student-t检验或方差分析（ANOVA）比较不同细胞处理组间p24抗原表达差异;采用重复测量数据的方差分析比较不同时间吗啡处理组比对照组的p24抗原表达增加或减少倍数的变化趋势.结果 HIV-1感染MT2细胞后第3、4、5和6天,3个浓度的吗啡处理的（1）组的p24抗原表达[第3天：（4.44±0.30）、（5.59±0.25）和（4.60±0.24） ng/ml;第4天：（24.30±2.66）、（31.73±1.17）和（26.02±0.37） ng/ml;第5天：（56.30±1.26）、（81.77±2.49）和（63.66±2.57） ng/ml;第6天：（150.70±8.97）、（243.09±8.93）和（173.72±7.73） ng/ml]均高于（4）组[第3~6天分别为（1.93±0.05）、（8.03±0.09）、（15.30±0.91）、（41.01±0.84） ng/ml],差异有统计学意义（第3天：t值分别为14.15、24.74和19.14,P均〈0.01;第4天：t值分别为10.59、34.92和81.2,P均〈0.01;第5天：t值分别为45.83、43.51和30.07,P均〈0.01;第6天：t值分别为20.09、39.02和29.55,P均〈0.01）.3个浓度的吗啡处理的（1）组的p24抗原表达比（4）组增加的倍数,随HIV-1感染MT2细胞的时间的延长具有上升的趋势,时间效应具有统计学意义（F=842.18,P〈0.01）.HIV-1感染巨噬细胞组后第4、6、8和10天,3个浓度的吗啡处理的（5）组的p24抗原表达[第4天：（0.68±0.15）、（0.87±0.41）和（0.75±0.09） ng/ml;第6天：（1.64±0.57）、（2.07±0.12）和（1.75±0.17） ng/ml;第8天：（6.31±0.17）、（8.81±0.34）和（7.19±0.11） ng/ml;第10天：（32.30±17.55）、（50.74±17.55）和（39.74±0.56） ng/ml]均高于（8）组[第4、6、8、10天分别为（0.60±0.01）、（1.16±0.07）、（3.84±0.45）、（17.55±0.86） ng/ml],差异有统计学意义（第4天：t值分别为7.27、11.06和3.02,P均〈0.05;第6天：t值分别为8.93、11.3和5.45,P均〈0.01;第8天：t值分别为8.83、15.11和12.42,P均〈0.01;第10天：t值分别为13.65、17.84和36.69,P均〈0.01）.3个浓度的吗啡处理的（5）组的p24抗原表达比（8）组增加的倍数,随HIV-1感染时间的延长具有上升的趋势,时间效应具有统计学意义（F=135.58,P〈0.01）.结论 吗啡能够促进HIV-1在MT2细胞和巨噬细胞内的复制,并且随着感染时间的延长而增加;吗啡促进HIV-1复制的作用可被纳洛酮阻断.

人免疫缺陷病毒HBJ株的分离和生物学特性研究

目的 :分离和鉴定我国流行的人免疫缺陷病毒 (humanimmunodeficiencyvirus ,HIV)毒株 ,研究我国HIV毒株的生物学特性。方法 :用外周血单个核细胞 (peripheralbloodmononuclearcells ,PBMC)共培养的方法分离HIV ,用观察细胞病变、检测P2 4抗原和前病毒DNA的方法监测病毒生长的情况。结果 :在建立共培养的第 12天观察到明显的细胞病变 ,主要表现为大泡样细胞和多核巨细胞。接种第 9天细胞培养上清液的P2 4抗原由阴性转为阳性 ,并且浓度迅速增加 ,接种第 12天浓度即达到 1780pg/ml ,第 14天达到峰值 ,为 2 32 0pg/ml。但该株病毒的PBMC培养上清液转种于MT4细胞后 ,培养上清液P2 4抗原和前病毒DNA始终为阴性且不出现细胞病变。结论 :用PBMC共培养的方法从一名河北籍HIV感染者的PBMC分离出了人免疫缺陷病毒HB J株 ,它是快速生长的、嗜巨噬细胞的、致多核巨细胞形成的毒株 ,而且只感染新鲜的人PBMC而不感染传代人T淋巴细胞MT4 ,可能与使用的辅助受体有关 ,值得深入研究。