琼脂磁珠消减SELEX技术筛选HIV P24抗原适配体

建立以羧基化琼脂磁珠为筛选介质,快速筛选高特异性、高亲和力的HIV P24抗原适配体的方法.利用消减SELEX技术及靶标替换的方法,以HIV P24抗原作为靶分子,羧基化琼脂磁珠为载体,进行6轮筛选,筛选到3条特异性核酸适配体.特异性检测表明,筛选得到的HIV P24抗原适配体与HIV P24抗原的结合解离常数均在纳摩尔级水平.该方法为HIV早期检测提供了新的检测技术,对适配体与靶分子相互作用机理的研究具有重要价值.

采用抗体包被金磁纳米微粒修饰电极的HIV p24/gp36安培联检芯片

研制了以聚碳酸酯为基底的双通道安培检测微流控免疫芯片,在其中分别集成了修饰有HIV核心抗原p24/gp36的单克隆一级抗体的纳米金修饰电极,并应用于人血清中p24和gp36抗原的同时分析.检测原理是：基于夹心免疫分析法,在电压驱动下,一次性加入含有p24和gp36样品及HRP酶标记的p24和gp36二级抗体溶液,与电极表面的一级抗体生成夹心免疫复合物;接着在体系中加入H2O2,以方波溶出伏安法检测免疫复合物上HRP催化H2O2的还原电流.在pH为6.2的磷酸缓冲液中,对HIV p24和gp36的检测时间均少于2 min,线性范围为0.5-400μg/L,检测限为0.25μg/L.该芯片集成了加样、分离和检测系统,检测时间短,灵敏度明显高于传统的酶联免疫吸附分析法,可应用于对艾滋病的早期诊断和大范围筛查.

基于纳米金组合电极的HIV p24微流控安培免疫传感芯片研究

研制了以聚碳酸酯(PC)为基底,以表面修饰了人免疫缺陷病毒(HIV)核心抗原p24单克隆一级抗体(Rp24I)的纳米金组合电极(GNEE)为工作电极的微流控安培免疫传感芯片,并应用于p24抗原(简称p24)实时分析。检测原理是基于夹心免疫分析法,在电压驱动和流动条件下,一次性加入p24样品和纳米金胶标记的p24二级抗体(Rp24Ⅱ-Au,金胶直径为50～100nm)溶液,利用不同物质因受电场影响而在微管道中的迁移速率不同,使得p24抗原和Rp24Ⅱ-Au依次到达GNEE电极,与其表面的Rp24I生成三明治型免疫复合物(Rp24I/p24/Rp24Ⅱ-Au)。接着以方波溶出伏安法(SWSV)将复合物上的金胶粒子溶出,由于溶出电流大小与被测定p24呈正比关系,从而获得p24的测定校正曲线。在pH6.2的磷酸缓冲液(PBS)中p24检测时间小于2min,线性范围为1～500ng/L(R2=0.9975),检测限为0.25ng/L。该芯片集成了加样、分离和检测系统,简化了分析步骤,缩短了检测时间,灵敏度达1μA.ng-1.mL,明显高于传统酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,对艾滋病的早期诊断和大范围筛查具有应用价值。

应用梭状芽孢杆菌口服疫苗载体表达HIV p24蛋白的研究

应用一种不产毒的梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens,C.P.)作为口服疫苗载体表达HIVp24蛋白。用PCR扩增HIVp24基因,酶切后插入到含有C.P.序列的pJRC200质粒的CPEORF中,将重组的cp24质粒转化无致病作用的ATCC3624菌株。使HIVp24基因在C.P.形成芽孢时大量表达。结果应用SDS_PAGE和West Blot分析HIVp24在重组C.P.繁殖体和芽孢中的表达情况,发现HIVp24蛋白在C.P.芽孢体中大量表达,而在C.P.繁殖体中却没有表达。证明在体外构建了含有HIVp24基因的重组pJRC200质粒,成功地表达了HIVp24蛋白并得到了HIVp24的高表达ATCC3624菌株。为成功研究C.P.作为一种口服HIV疫苗载体奠定了基础。

基于磁性碳纳米管修饰印刷电极的无酶型HIV p24安培免疫传感器

在多壁碳纳米管(MWNTs)表面固定Fe3O4(核)/Au(壳)纳米微粒(GMP),使其具有超顺磁性,包被p24抗体(anti p24),制得检测探针(MWNTs-GMP/anti p24);在磁场作用下将此探针吸附于N,N'-双(2-羟基苯亚甲基)邻苯二胺合铜(CuRb)修饰的碳基丝网印刷电极(SPCE|CuRb)表面,制得了免疫传感电极(SPCE|CuRb/MWNTs-GMP/anti p24)。当此电极在含p24样本中于室温下温育15min后,随p24浓度的增加在电极表面生成的免疫复合物增加,导致CuRb对H2O2的催化还原电流下降。在含5mmol/L H2O2的PBS(pH7.0)中和-300mV下,催化还原电流降低值ΔIo与p24浓度在0.6～160μg/L呈线性关系;检出限为0.32μg/L(3σ)。将其用于实际样品检测,结果与标准EILSA方法一致。由于MWNTs-GMP/anti p24具有超顺磁性,并可以显著提高电极比表面积及anti p24负载量,而CuRb代替易失活的HRP酶,使得该传感器灵敏度和稳定性俱佳,电极表面可更新,可用于艾滋病人血清中p24筛测。

抗HIV p24和人A型红细胞双特异性单克隆抗体的研制

目的 :制备抗HIVp2 4和人A型红细胞双特异性单抗 (mAb) ,并建立检测HIVp2 4的间接血凝试验。方法 :将分泌抗HIVp2 4mAb的杂交瘤株 2 E4和分泌抗人A型红细胞mAb的杂交瘤株S2 ,分别用 8 Ag和 5 BrdU驯化 ,使成为HAT敏感株。将两者常规融合 ,筛选分泌双特异性mAb的杂交 杂交瘤株。然后制备并纯化双特异性mAb ,用其建立的间接血凝法检测p2 4。结果 :共获得 6株杂交 杂交瘤细胞株 ,以其分泌的双特异性mAb建立了检测HIVp2 4的间接血凝法 ,敏感性可达 4 0 0ng/L。结论 :获得可稳定分泌双特异性mAb的杂交 杂交瘤株 ,并用纯化的双特异性mAb建立了快速检测HIVp2

HIV-p24抗原的电化学免疫传感器研究

制备了一种基于巯基丁二胺铜（Ⅱ）（CuL）的自组装修饰传感器，用于人血清中HIV-p24水平免疫分析。其主要参数为：电极表面直径2mm、高2cm，CuL覆盖率为1．02×10^-11 mol/cm^2，检测用血量〈10mL，检测速度〈10S。其电化学行为表现出表面控制过程。结合电化学酶联免疫分析法，在含有1．0mmol/L H2O2的pH：6．2磷酸盐缓冲溶液中，获得HIV-p24的测定校正曲线为0．5-200ng/mL，检测限为0．2ng/mL。该传感器准确性、精确性和制备重复性良好。测定10ng/mL HIV-p24时的变异系数为3．5％。该方法避免了常规电化学免疫测定中电子媒介体的加入，简化了分析步骤，缩短了分析时间。对艾滋病的诊断和检测具有一定价值。该研究的新颖性，已为宁波市科学技术情报研究所2006年9月20日出具的第20063360800348号《科技查新报告》所证实，属未见文献报道。

HIV核心抗原p24检测方法的建立及应用

ＨＩＶ感染的检测在预防ＡＩＤＳ传播方面有重要作用。本研究以重组抗原ｐＧ１免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术建立了５株识别ＨＩＶ核心抗原ｐ２４的杂交瘤细胞株Ｄ３，１Ｈ１，２Ｇ１０，３Ｈ５和４Ｈ６。经鉴定这５株ＭｃＡｂ与其它病毒抗原无交叉反应，分别识别３个不同的抗原表位。应用两株识别不同表位的ＭｃＡｂ２Ｇ１０和３Ｈ５建立了检测ＨＩＶｐ２４抗原的夹心ＥＬＩＳＡ法，并初步检测了２４份ＨＩＶ抗体阳性血清。

HIV-1 p24抗原检测的应用研究

目的 :用抗HIV 1p2 4单克隆抗体和多克隆抗体构建的间接ELISA试剂 ,检测HIV 1抗体阳性及其它样品 ,探讨应用的可行性。方法 :采用单克隆抗体固相、兔抗HIV 1p2 4抗体夹心 ,羊抗兔HRP结合物的间接ELISA法。结果 :显示试剂盒HIV 1p2 4抗原检出灵敏度为 5 0pg/ml(基因工程抗原 ) ;特异性 99 46 % ;HIV抗体阳性血样阳性率 3 2 % ;抗体阴性的特殊人群血样阳性率 3 9% ;抗体不确定血样阳性率为 15 4% ,明显高于抗体阳性和阴性组血样。病毒培养 1d ,抗原效价 1∶80 ,第 3天可达1∶5 12 0。结论 :该间接夹心HIV 1p2 4抗原检测试剂灵敏度高、特异性好 ,可应用于HIV感染的辅助检测及病毒的基础研究。

HIV-1型衣壳蛋白P24在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

用聚合酶链式反应 (PCR)从 HIV - 1gag基因序列中扩增出衣壳蛋白 (P2 4)基因 ,插入表达载体p GEX- 4T3中 ,构成重组质粒 p GEX- p2 4,在大肠杆菌 BL 2 1中高效表达出重组 P2 4。经 Glutathione- Sepharose4B亲和层析纯化后 ,重组 P2 4在间接 EL ISA和免疫印迹中表现出很高的抗原特异性和免疫反应性。

HIV-P24核酸适配体的筛选

目的利用SELEX技术筛选HIV-P24的核酸适配体,为艾滋病的诊断和治疗奠定基础。方法以重组P24为筛选靶,用SELEX技术从随机寡核苷酸库中筛选与HIV-P24结合的寡核苷酸,利用凝胶阻滞实验鉴定第12轮筛选到的寡核苷酸与HIV-P24的结合,再用Dot-blot法筛选出与HIV-P24结合的核酸适配体,并检测核酸适配体识别HIV-P24的特异性。结果 Dot-blot筛选到5条与HIV-P24有较强结合能力的核酸适配体,且均为不同的序列。特异性检测显示,18和26号配体只与HIV-P24特异性结合,而与人血清白蛋白、牛血清白蛋白和脱脂奶粉均无明显结合。结论成功筛选到2条特异结合HIV-P24的核酸适配体,为其应用于艾滋病诊断和治疗提供了实验基础。

抗HIV-1核心抗原p24单克隆抗体的制备及特性的初步鉴定

目的 :建立分泌抗HIV 1p2 4单克隆抗体 (mAb)的杂交瘤细胞株 ,并对其特性进行初步鉴定。方法 :以纯化的基因工程制备的p2 4抗原免疫BALB/c小鼠 ,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2 /0骨髓瘤细胞融合 ,经HAT、HT选择培养及有限稀释法进行克隆化后 ,用间接ELISA法及Dotblot对其进行筛选和特性鉴定。结果 :筛选到 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,其腹水效价为 1×10 -5,亲和力为 1.7× 10 4～ 1.8×10 4mol/L ,mAb的Ig亚类均为IgG1。两株mAb与HBcAg、HCVRNA阳性血清及HIVgp4 1等均无交叉反应 ,只与HIV 1p2 4抗原阳性血清产生特异反应。结论 :成功地建立了 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,为进一步研制HIV 1p2

HIV(1+2)抗体/P24抗原联合法与胶体硒法在临床检测HIV中的应用研究

目的比较第4代酶联免疫吸附测定(ELISA)[HIV(1+2)抗体与P24抗原联合检测]和胶体硒法在临床检测HIV中的特点。方法分别用第4代ELISA检测试剂和胶体硒试剂检测HIV抗体,初筛阳性样本送重庆市疾病预防控制中心进行Western blot确证试验。结果第4代ELISA试剂检测、胶体硒检测及Western blot检测HIV的阳性率分别为0.34%、0.29%及0.27%。第4代ELISA的HIV漏检率(1.3%)低于胶体硒法(4.9%),而其检测HIV的假阳性率(0.03%)高于胶体硒试剂(0.01%)。结论第4代ELISA和胶体硒法联合应用可提高HIV检测的准确性。

金磁微粒为载体的免疫PCR检测HIV-1 p24

目的建立以金磁微粒为载体的免疫PCR HIV-1 p24检测体系。方法以金磁微粒作为免疫PCR的载体并通过载体的特异性和非特异性反应验证其可行性;以小鼠抗HIV-1 p24单克隆抗体作为捕获抗体包被金磁微粒,生物素化的羊抗p24多克隆抗体作为检测抗体;报告DNA用生物素标记的引物通过PCR扩增预先制备,并通过链亲和素的桥联标记生物素化的多抗,被两抗体夹心捕获的人重组HIV-1 p24抗原通过PCR扩增报告DNA的方式予以检测;并对检测的灵敏度和线性检测范围进行分析。结果金磁微粒上偶联抗体的效率可〉95%,偶联抗体的一致性较好,几乎不产生非特异性吸附,分离与洗涤步骤更简便更彻底;免疫PCR检测p24的灵敏度为0.1ng/L,比ELISA法检测的灵敏度高1.5×10^4倍,线性检测范围为p24浓度在0.1～100ng/L。结论金磁微粒是较理想的免疫PCR反应载体,金磁微粒为载体的免疫PCR检测HIV-1 p24是一种可兹应用的高灵敏度的检测方法。

HIV-1P24抗原国家参考品的研制

收集正常人、HIV感染者和疑似感染者血浆以及HIV-1病毒培养裂解液,对其进行HIV抗体、HIVP24抗原、HCV抗体和HBsAg检测,对HIVP24抗原阳性者进行HIVRNA检测,并对部分样品进行基因分型。以NIBSCP24抗原标准品的系列稀释样品作为线性灵敏度参考品。经过实验筛选出20份阴性参考品,10份阳性参考品,10份线性灵敏度参考品,2份精密性参考品,共同组成HIV-1P24抗原国家参考品,经多家不同的试剂进行标定,制定了相应的标准。稳定性研究结果表明,反复冻融三次对该参考品的稳定性没有影响。由此,初步建立了HIV-1P24抗原国家参考品,该参考品将对HIV-1P24抗原、HIV抗体/P24抗原联合检测试剂的质量控制提供重要依据。

HIV-1核蛋白p24在昆虫细胞中的表达

将完整的ＨＩＶ－１ｐ２４基因克隆到杆状病毒转移质粒中。使用重组转移质粒与野生型杆状病毒（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ共转染Ｓｆ９昆虫细胞，经筛选获得带有编码ｐ２４基因的重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Ｓｆ９细胞后在细胞中表达了ＨＩＶ核蛋白ｐ２４。其重组蛋白的分子量为２４ｋＤ。此重组糖蛋白在免疫荧光，免疫印染和酶联免疫实验中都能被人ＨＩＶ－１阳性血清和单克隆抗体所识别。

抗HIV-p24单克隆抗体细胞株的建立及初步应用

拟建立抗HIV-p24蛋白的单克隆抗体细胞株及双抗体夹心法,用于检测艾滋病病人血清中的p24抗原。用纯化的基因工程表达的HIV-p24蛋白免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞融合,有限稀释法克隆细胞,ELISA筛选特异性抗体。结果克隆筛选出12株细胞,初步建立了检测HIV-p24抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验。本方法为监控艾滋病病毒感染的窗口期和艾滋病病人临床治疗效果提供了检测手段。

巯基丁二胺铜单层修饰金电极上HIV-p24抗原的电化学免疫检测

制备了用巯基丁二胺铜(CuL)修饰的金电极并用作HIV-p24抗原蛋白(简称p24)免疫检测的化学传感器。CuL通过单层自组装固定在金电极表面,其覆盖率为1.02×10-11mol.cm-2,在含有1.0 mmol.L-1过氧化氢并在pH 6.2的磷酸盐缓冲溶液中,制备的校正曲线的线性范围为0.5-150μg.L-1p24对相应的伏安响应,方法的检出限为0.2μg.L-1。在10μg.L-1p24浓度水平作精密度试验,得RSD值为3.5%,于试样中分别加入5,15,20及30μg.L-1p24进行回收率试验,所得结果在98%-102%之间。此方法毋需另加电子传递媒介体。应用此方法于临床血清分析,所得结果与放射性免疫法的结果一致,且所得RSD值均小于0.3%。

HIV-1Gagp24蛋白的纯化及复性

为制备高纯度p24 抗原,在变性条件下,将大肠杆菌表达的重组p24 蛋白,使用Ni-NTA 亲和层析法进行了纯化。对包涵体中的p24 蛋白进行层析纯化时,回收率略有提高,但蛋白纯度(81% )低于菌体裂解纯化洗脱物(94% )。菌体中及纯化、复性后的目的蛋白均能与抗HIV-1 p24 单克隆抗体发生特异性反应。用纯化的p24 蛋白免疫小鼠,4 周时小鼠血清抗p24 平均抗体效价达1∶400。试验结果表明,大肠杆菌表达的HIV-1 p24 全菌体裂解物纯化后,可用作HIV-1 检测试剂的原料。

免疫PCR检测HIV-p24抗原的实验研究

目的建立检测HIV-p24抗原的高灵敏度免疫PCR方法。方法以金磁微粒为免疫PCR载体、鼠抗HIV-p24单抗为捕获抗体、生物素化的羊抗p24多克隆抗体为检测抗体,通过链亲和素的桥联标记生物素化的多抗,被双抗体夹心捕获的人重组HIV-p24抗原通过PCR扩增报告DNA的方式予以检测;用方阵滴定法确定最适链亲和素和标记DNA浓度,用Quantity One凝胶定量软件分析电泳图像。结果链亲和素浓度和用于标记的DNA的浓度分别控制在0.1mg/L和10ng/L;免疫PCR检测的灵敏度为0.1ng/L,比传统ELISA法检测的灵敏度高。结论高灵敏度的免疫PCR适用于早期筛检HIV-p24抗原。