RT-PCR扩增HIV-1基因gag区多个片段早期诊断HIV感染

目的 :建立 RT- PCR(逆转录多聚酶链式反应 )扩增 HIV核酸的检测方法并将其应用到 HIV感染的早期诊断中。方法 :合成 HIV- 1(艾滋病毒 1型 )基因组 gag区 9条引物 ,从 HIV1+2蛋白印迹法确定为抗体阳性、并经病毒载量检测阳性的 HIV感染者血浆中提取 HIV- 1RNA,应用 9条引物的随机组合 RT- PCR扩增 HIV gag区核酸片断 ,筛选出扩增灵敏度最高的 3个扩增片断。从血浆 HIV病毒载量大于 5 0 0 copy/ ml的 HIV感染者和正常人血浆中提取病毒 RNA,应用上述 3个扩增片断的引物组合 RT- PCR扩增样本核酸 ,PCR产物经凝胶电泳观察 ,判断待检病人是否感染。结果 :该方法的敏感性为 96 % ,特异性为 10 0 % ,3个片断扩增灵敏度分别为 76 %、 87%、 73%。结论 :应用 RT- PCR扩增 HIV核酸保守区多个基因片断 ,具有较高的灵敏度和特异度 ,方法简单 ,可以应用到

q^2引导构象选择CoMFA方法研究HIV-1 RT抑制剂

对未知受体结构的药物设计其主导方法CoMFA来说,柔性目标分子的多种构象造成了问题的复杂性.本文介绍交叉验证参数R^2(q^2)引导的构象选择CoMFA方法,选择化合物的最佳构象.将一组47个HIV-1 RT抑制剂进行有、无构象选择的CoMFA分析来作评价.根据化合物的活性、毒性、选择性指数(毒性/活性比)等实验数据构建得到的模型,其交叉验证参数q^2为0.7以上,非交叉验证的相应参数为0.94以上,最后,还经过试验集化合物验证该模型的预测能力,置信度(1-α)>0.99.

复叶耳蕨提取物体外抗HIV-1 RT活性的研究

目的对鳞毛蕨科复叶耳蕨属植物复叶耳蕨不同提取部位体外抗HIV-1逆转录酶活性进行研究。方法在体外无细胞系统内采用酶联免疫吸附测定HIV-1逆转录酶的半数有效浓度(IC50)。结果复叶耳蕨乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物抑制HIV-1逆转录酶的半数有效浓度IC50分别为84.069,.74μg.ml-1,水提取物抑制HIV-1逆转录酶的半数有效浓度IC50>200μg.ml-1。结论复叶耳蕨乙酸乙酯提取物与正丁醇提取物具有体外抑制HIV-1逆转录酶作用。

用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测HIV-1感染

为了解决窗口期和发病期的 HIV- 1感染者中，抗体产生不足和 (或 )由于病毒大量复制中和了血液中的抗体，用检测抗体的常规方法难以确认，这一个困扰临床和防疫工作者的难题，我们建立了用逆转录-聚合酶链反应检测 HIV- 1感染者血清中病原体的方法。其优点为： (1)敏感性强，检测结果无假阴性反应； (2)扩增 HIV- 1的 gag,pol和 env三个基因区的保守基因片段，且每个片段都做巢式扩增，并规定扩增出两个片段才能确认，特异性为 100％； (3)所用的引物不仅能检测出中国的 HIV- 1流行株，也能检出非洲的 HIV- 1流行株； (4)使用了 RNA提取试剂盒，可直接利用筛选试验剩余的血清作标本，标本用量少 (200μ L)，方法相对较简便。

圆锥乌头多糖脱蛋白及抗HIV-1 RT活性研究

目的从圆锥乌头Aconitum paniculigerum Nakai中提取多糖,并研究圆锥乌头多糖体外抗HIV-1逆转录酶(HIV-1 RT)的活性。方法利用水提醇沉法从圆锥乌头中提取多糖,加入胰蛋白酶脱除粗多糖中的蛋白质,通过苯酚硫酸法计算粗多糖中的多糖含量,通过考马斯亮蓝法计算蛋白脱除率。以奈韦拉平为阳性对照药测试圆锥乌头多糖体外抗HIV-1逆转录酶(HIV-1 RT)的活性。结果圆锥乌头粗多糖质量百分得率为18.86%;最佳蛋白脱除方法为加入粗多糖量30%的胰蛋白酶,脱除率达到89.2%;对HIV-1逆转录酶(HIV-1 RT)的半抑制率IC50为95.04μg.mL-1。结论圆锥乌头药材中粗多糖含量比较高且具有抗HIV-1逆转录酶(HIV-1 RT)的活性。

HIV-1实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒的比较实验

目的比较及评价市场上主流的3个进口品牌(A-QIAGEN、B-Applied Biosystems、C-Promega) HIV-1病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒的特异性、灵敏度、稳定性及所需反应时间,确定3者中较优的试剂盒,为临床HIV-1病毒的核酸检测提供方法学参考。方法根据3个品牌试剂盒的说明书,对系列稀释的国内HIV-1 RNA标准品和确证的HIV阴性的标本进行相应的荧光定量RT-PCR平行检测分析,最后将荧光收集值(RFU)均设定为100,结合扩增曲线图、Ct值及相应的分析,比较它们的特异性、灵敏度、稳定性及所需反应时间。结果 3种试剂盒的特异性都是100%,但B-Applied Biosystems试剂盒在灵敏度(比A-QIAGEN、C-Promega试剂盒的检出Ct值提前0. 4-1. 5)、稳定性(特别是低浓度(HIV-1 RNA标本浓度为2. 31×102)时)及所需反应时间上均优于A-QIAGEN试剂盒和C-Promega试剂盒。结论不同厂家检测试剂盒的特异性、灵敏度等方面存在一定的差异,导致同样的标本检测的结果会有一定的偏差,甚至漏检。因此,进行临床检测前需要对这些检测试剂盒进行评估。

1-(3-酞酰亚胺基-2-氧丁基 )-4-取代苯基哌嗪的合成及抗HIV-1逆转录酶活性(英文)

目的 合成新型的非核苷类 (双杂环苯基 )化合物 ,并观察其抗HIV1 逆转录酶 (HIV1 RT)活性。方法 以氮芥盐酸盐为起始原料 ,与不同取代苯胺反应 ,得到相应的不同取代的哌嗪盐酸盐 ,并与 1 溴 3 酞酰亚胺基 2 丁酮 (4)缩合 ,得到目标化合物。结果 合成 11个目标化合物 (5～ 15 )。经1HNMR ,红外和元素分析确定结构。结论 经HIV逆转录酶P 6 6蛋白测定 ,化合物 11,14 ,10和 13有一定抑制HIV1 RT活性 ,其IC50 分别为 2 9 80 ,35 2 0 ,4 3 77和 6 3 76 μmol·L-1。

深圳地区HIV-1感染者的本底耐药水平调查初探

[目的]建立一套完善,可靠,适合深圳人群的HIV-1耐药性基因型检测方法,调查分析深圳地区未接受抗病毒治疗的HIV感染者/AIDS患者的病毒株耐药突变及其本底流行情况。[方法]从未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者血浆中提取病毒RNA,采用RT-PCR扩增目的基因片断,并对扩增片断进行序列测定和分析。[结果]通过HIV-1耐药性基因型检测法能够获得1300bp长度的目的基因片断。经序列分析所得的21份RT基因结果中有8份对NRTI产生耐药突变(38.5%),5份对NNRTI产生耐药突变(23.81%);另外分析所得的12份PR基因结果中1份产生对蛋白酶抑制剂主要耐药突变(8.33%),5份产生对蛋白酶抑制剂次要耐药突变(41.67%)。[结论]HIV-1耐药性基因型检测法能有效地监测HIV-1感染者血浆中的耐药性病毒株的存在,并且检测结果表明,深圳地区未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者中已经存在耐药突变株。

HEPT类HIV-1逆转录酶抑制剂的研究进展

逆转录酶是设计抗艾滋病药物研究的选择性靶酶 ,从作用机制、构效关系等方面综述HEPT及其类似物作为HIV 1逆转录酶抑制剂的研究进展。

用两步MS-PCR结合ELISA检测HIV-1逆转录酶基因的耐药性突变

高效抗逆转录病毒治疗法(HAART)的推广使用有效地抑制了HIV-1病毒的传播和艾滋病(AIDS)的发病率、死亡率。近年来,HIV-1逆转录酶基因突变所导致的耐药性已成为HAART治疗失败的主要原因,耐药性突变的检测对于指导病人用药以及新药开发具有重要意义。发展了一种检测HIV-1逆转录酶基因耐药性突变的新方法。采用两步MS-PCR方法检测HIV-1B亚型野生型和耐药突变型逆转录酶基因突变,检测点包括M41L、K70R、K103N、Y181C和T215,并在两步MS-PCR基础上,设计比野生型引物长的突变型引物,结合微孔板杂交ELISA呈色技术检测各点突变。结果显示,简化的两步MS-PCR能保持灵敏度和特异性高的优点,ELISA的阳性结果与阴性结果的比值(P/N)达到要求,两步MS-PCR结合ELISA方法灵敏度高,操作简单、结果直观、成本低、相对耗时短且能进行高通量检测,使其无论在HIV-1耐药性突变及其它的点突变检测中都具有较好的临床应用前景。

HIV-1抗体蛋白印迹确认与核酸检测复核对比研究

应用病毒核酸载量法NASBA和HIV-1 RNA的巢式逆转录PCR(nested RT-PCR)法与HIV抗体蛋白印迹(WB)方法,对经过初筛的44例HIV-1抗体阳性标本进行了对照检测研究。发现了2例(gp160、p24)和1例(gp160g、p120p、66、p24)的特殊阳性样本,经NASBA法和该RT-PCR法核酸检测为阴性;WB确认的4例gp160阳性带、1例p24、p17阳性带和13例p24阳性带,经NASBA法和该RT-PCR法核酸检测也为阴性;而WB确认的其余全部带型的抗体阳性标本经过NASBA法和该RT-PCR法检测均为阳性。该研究表明对只有gp160p、24和gp160、gp120p、66、p24的特殊阳性标本和以p24为主的抗体不确定标本需要用RT-PCR或NASBA方法进行核酸检测,以进一步确认。

HIV-1 gag与gp41基因片段的序列特征与亚型研究

本文对华北地区出入境39例HIV-1阳性样本(中国21例,非洲17例,东南亚1例)的gag和env两个基因片段进行了序列特征和亚型对比分析。发现了A、A1、A3、B、C、G亚型和重组亚型03_AB、01_AE、AG、02_AG、07_BC、08_BC、CD和06_CPX共14个亚型,其中重组亚型占57.2%(8/14)。表明HIV-1基因变异较快,亚型分布广泛,重组亚型有增多趋势。此外发现26.7%(8/30)的样本,其gag和env基因区亚型表现不一致。提示在研究HIV-1亚型中应综合gag和env两个基因区的序列特征进行亚型分析。

应用HIV-1耐药性基因型检测广东部分地区HIV耐药株

目的利用艾滋病病毒1型(HIV-1)耐药性基因型检测法,在HIV-1感染者中监测HIV-1耐药性病毒株,掌握广东省HIV-1感染者在利用抗病毒药物治疗前是否存在耐药突变及其流行情况。方法从未接受高效抗逆转录病毒联合疗法(HAART)治疗的HIV-1感染者血浆中提取病毒RNA,采用套式PCR扩增目的基因片断,并对扩增片断进行序列测定和分析。结果HIV-1耐药性基因型检测法能够从HIV-1感染者血浆病毒载量大于1 000拷贝/ml以上、CD4低于400以下的样本中扩增到目的片断。在广东省50例未治疗对象中,低中度耐药相关突变例数为2例,占4%;高度耐药相关突变例数为0;总耐药相关突变例数为2例,占4%。结论HIV-1耐药性基因型检测法能有效地监测HIV-1感染者血浆中的耐药性病毒株的存在,并且方法提供的结果准确、可靠。对广东省未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者中耐药突变的检测表明,HIV-1感染者中存在病毒的耐药性突变,也反应了HIV毒株自然变异情况的存在。

非核苷类HIV-1逆转录酶抑制剂研究进展(待续)

逆转录酶是设计抗艾滋病药物研究的选择性的靶点,逆转录酶抑制剂主要分为核苷类和非核苷类两大类,本文主要根据化学结构类型综述近年来非核苷类HIV-1逆转录酶抑制剂的研究进展。

HIV-1耐药性基因型检测法在临床治疗随访中的应用

目的 探索HIV-1耐药性基因型检测法在高效抗逆转录病毒疗法（HAART）治疗组中监测HIV-1耐药性病毒株的临床应用。方法 从接受HAART的HIV-1感染者血浆中抽提病毒RNA,采用套式RT-PCR方法扩增HIV-1的PR和RT基因片段,并对扩增片段进行序列测定和分析。结果HIV-1耐药性基因型检测法能够从血浆病毒载量在 1000拷贝/ml以上的样本中得到扩增产物。在 16例接受 HAART的 HIV-1感染者中,发现 1例感染者 DP31的 PR和 RT基因出现了突变,这些突变为L63P、T215F、K219Q和M184V。所有突变均与公开报道的结果一致,并被证明与HIV-1的耐药性有关。另外,DP31在接受HAART前已出现T215F、K219Q的耐药性突变,究其原因,还有待进一步研究。结论HIV-1耐药性基因型检测法能有效地监测接受HAART的HIV-1感染者血浆中耐药性病毒株的存在。该方法提供的结果准确、可靠,并且为临床医生评价HAART效果,合理选择和及时优化药物组合方案提供了可靠的依据。

逆转录—聚合酶链反应在HIV-1感染诊断中的应用

[目的 ]评价逆转录 -聚合酶链反应 (RT PCR)在HIV 1感染诊断中的应用。[方法 ]采用RNA一步法试剂盒提取RNA。用 3套分别来自于LTR gag、pol、env不同区域的序列引物进行嵌套式PCR扩增。[结果 ]对 2 4例血清标本进行检测 ,其中 15例为HIV感染者 ;1例为免疫印迹试验可疑待确定 ,但经过 1年的随访可排除 ;另外 8例为正常者。经过巢式扩增 ,15份阳性标本中有 14份扩增出两条或两条以上核酸片段 ,1份未扩增出任何一条片段 ,其敏感性达93 3 % ( 14 /15 )。其中 6份肝素抗凝标本env区域均未扩增出片段。阴性标本无片段 ,其特异性为 10 0 % ( 8/8)。[结论 ]RT PCR具有高敏感性和特异性 ,可用于窗口期HIV感染的诊断及HIV 1阳性母亲所生婴儿的HIV检测 ,可作为免疫印迹试验的补充和辅助诊断。

HIV-1感染者肠道产丁酸菌F.prausnitzii和R.intestinalis变化特点

目的初步探讨2种肠道产丁酸菌F.prausnitzii和R.intestinalis在HIV-1感染中的特点以及与疾病进展的关系。方法20例未治疗HIV-1感染者纳入研究对象(HIV-1感染组),以20例年龄、性别等相匹配的健康人作为对照。收集研究对象的血液及粪便标本。提取粪便细菌基因组DNA,应用实时荧光定量PCR方法对2种产丁酸菌进行定量分析,检测患者的临床指标,用SPSS 20.0软件进行统计学分析。结果对照组与HIV-1感染组中F.prausnitzii拷贝数(log)分别为(7.47±7.48)copies/μl、(7.46±7.42)copies/μl,R.intestinalis拷贝数(log)分别为(6.74±6.75)copies/μl、(6.45±6.44)copies/μl,2组之间差异均无统计学意义(P均>0.05)。2组粪便中F.prausnitzii水平均高于R.intestinalis。2种细菌的拷贝数呈正相关(对照组r=0.447,HIV-1感染组r=0.499)。HIV-1感染组F.prausnitzii的拷贝数与CD4+/CD8+T细胞比值呈正相关(r=0.573)。结论HIV-1感染后产丁酸的优势菌株F.prausnitzii与CD4+/CD8+T细胞比值呈正相关,该细菌可能与免疫状态相关。

荧光定量PCR用于hTRIMCyPA抑制HIV-1的研究

目的:建立相对荧光定量PCR测定HIV-1晚期反转录产物方法,并以其评价hTRIMCyPA对HIV-1的抑制作用。方法:选择HIV-1的LTR区和HIV-1Gag之间的序列设计晚期反转录产物引物,以GAPDH基因为内参基因,建立SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR测定HIV-1晚期反转录产物的体系,并用来评价hTRIMCyPA重组蛋白对HIV-1晚期反转录产物的影响。结果:在建立的荧光定量PCR体系中,晚期反转录产物和内参GAPDH标准曲线的斜率分别为-3.381、-3.289。相关系数R 2分别为0.9929、0.9937,均>0.99,表明二者的线性较好,晚期反转录产物基因及参照基因GAPDH基因扩增效率相同,可用于相对定量分析。hTRIMCyPA表达组HIV-1相对晚期反转录产物量明显少于空载体组。结论:本研究建立的定量HIV-1特异性反转录产物相对荧光定量PCR检测方法简单、高效和成本低廉,并且hTRIMCyPA对HIV-1反转录具有明显抑制作用。

CEMx174细胞中SAMHD1蛋白表达与SIVmac239病毒水平的相关性研究

目的研究SIV在感染CEMx174细胞过程中,SAMHD1在基因和蛋白水平的变化与病毒水平之间的相关性。方法 SIVmac239病毒感染CEMx174细胞后,每天收集上清和细胞,应用Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR方法,检测细胞内SAMHD1 mRNA的相对表达量的变化;用Western blot检测SAMHD1蛋白与SIVmac239P27蛋白表达量的变化,并分析其相关性。结果 CEMx174细胞感染SIVmac239后,细胞中的SAMHD1 mRNA基于内参基因GAPDH的相对表达量逐渐增加,前3 d分别增加了14%,16%,42%,随后开始迅速增加,第4天达到了200%,第6天更是达到了890%;细胞中SAMHD1蛋白的表达量在感染后第1、2天时变化不大,随后逐渐降低,到第5、6天时,几乎检测不到,呈现逐渐下降的趋势。结论 CEMx174细胞感染SIVmac239后,SAMHD1基因表达上调,与上清中病毒载量水平正相关,细胞内SAMHD1蛋白水平与SIVmac239 P27蛋白水平呈负相关。

RT-PCR和NASBA方法检测HIV-1感染者病毒载量结果分析

目的比较逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)和核酸序列依赖性扩增反应(NASBA)两种方法检测人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染者病毒载量的相关性和一致性。方法采用RT-PCR和NASBA方法平行检测30例新发现的HIV-1感染者病毒载量,并将检测结果进行统计分析。结果 RT-PCR和NASBA方法检测30例新发现HIV-1感染者病毒载量均值分别为(5.188±0.703)Log/mL和(5.135±0.903)Log/mL,差异无统计学意义(P>0.05)。相关性分析显示两种方法检测HIV-1感染者病毒载量呈显著直线相关(r=0.811,P<0.000 1),Bland-Altman分析显示两种方法检测HIV-1感染者病毒载量具有较好的一致性。结论 RT-PCR和NASBA方法检测HIV-1感染者病毒载量具有较好的相关性及一致性。