穿膜肽HIV-Tat_(49-57)和CTL表位融合多肽疫苗的初步免疫学效应研究

目的 探讨穿膜肽HIV Tat4 9- 57将CTL表位带入活细胞胞质并将其投入MHC Ⅰ类抗原提呈途径的可能性。方法 应用多肽固相合成技术 ,分别合成含HIVTat4 9- 57和HLA A2 1限制性CTL优势表位MART 12 7- 35的 18肽和该CTL表位 9肽。采用间接免疫荧光与激光共聚焦显微镜技术 ,分别对上述 18肽和 9肽的穿膜能力进行了动态观察。进一步用标准51 Gr释放试验分别检测了上述 18肽和 9肽在HLA A2 1阳性健康者外周血单个核细胞 (PBMC)中诱导的表位MART 12 7- 35特异性CTL活性。结果 18肽能够穿过活哺乳动物细胞质膜进入胞质 ,并呈现出时间、剂量依赖关系 ;而 9肽则无此效应。与 9肽相比 ,18肽在体外诱导出了明显增强的特异性CTL活性 (P <0 0 5 )。结论 穿膜肽HIVTat4 9- 57可有效携带CTL表位穿过细胞膜进入胞质 ,并有效激发出针对该表位的特异性CTL应答 。

CPP Tat_(49-57)促进外源CTL表位进入MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的机制研究

目的研究穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPP)促进外源CTL表位进入抗原呈递细胞(antigen-presenting cell,APC)内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的效应及呈递机制。方法应用多肽固相合成技术,将源于HIV-Tat的穿膜序列Tat49-57连接在H-2Kb限制性CTL表位OVA257-264的氨基端形成融合肽即Tat49-57-CTL257-264,同时合成该表位和氨基端自然延伸的对照肽NH2 extended-OVA257-264。采用流式细胞仪(FACS)分析技术,检测APC对各肽的MHC-Ⅰ类抗原呈递动力学,并进行MHC-Ⅰ类抗原呈递阻断和TAP依赖性实验。结果在所测时间点,APC对于Tat49-57-CTL257-264的呈递强度均明显高于NH2 extended-OVA257-264;氨基肽酶抑制剂Bestatin可部分抑制APC对于Tat49-57-CTL257-264的MHC-Ⅰ类抗原呈递,而蛋白酶体抑制剂Lactacystin则无抑制效应;Tat49-57-OVA257-264可被TAP缺陷细胞RMA-S内MHC-Ⅰ类分子有效呈递,其呈递强度远超过RMA-S细胞对NH2extended-OVA257-264的呈递。此外,RMAS固定后则丧失对Tat49-57-OVA257-264和NH2 extended-OVA257-264的MHC-Ⅰ类限制性呈递能力,但其表面的“空”MHC-Ⅰ类分子仍可呈递单纯表位肽OVA257-264。结论CPP Tat49-57可有效促进与之融合的CTL表位肽被细胞内MHC-Ⅰ类分子提呈,表现为动力学显著增强,且该过程表现为蛋白酶体/TAP非依赖、氨基肽酶依赖。

HIV-1 Tat_(49-57)/HPV16 E7_(49-57)/pGM-CSF纳米颗粒疫苗抗肿瘤研究

目的探讨HIV-1 Tat49-57-HPV16 E749-57CTL融合多肽与pORF9-mGMCSF质粒自组装成的纳米颗粒的抗肿瘤能力。方法合成Tat49-57-HPV16 E749-57融合肽,以富含正电荷的Tat49-57与表达mGM-CSF的DNA质粒通过静电引力作用自组装成纳米粒。凝胶阻滞实验、DNase I保护实验、透射电镜和Western blot等方法对纳米颗粒进行鉴定。构建预防性及治疗性肿瘤动物模型观察Tat-E7/pGM-CSF纳米颗粒疫苗在动物模型体内抗瘤效应。结果构建Tat-E7/pGM-CSF纳米颗粒,确定最适多肽/DNA电比r=2.0;当r=2.0时所制备的颗粒为类圆形,大小均匀一致,绝大部分颗粒直径均分布于20~80 nm之间。该纳米颗粒疫苗显著制了荷瘤小鼠的肿瘤生长,延长其存活时间,提高了存活率。结论 Tat-E7/pGM-CSF融合性纳米颗粒疫苗动物模型的在体抗肿研究证实了其具有良好效果。

Tat-E7/pORF-mGM-CSF颗粒疫苗的特异性CTL效应研究

目的前期制备并鉴定了Tat-E7/pORF-mGM-CSF颗粒疫苗,并在小鼠体内观察到良好的抗肿瘤效果,但其体内具体分子机制不清。本研究拟进一步利用该疫苗免疫小鼠,分析其体内激活T细胞应答的分子机制。方法通过免疫组化检测该纳米颗粒能否将外源基因转入哺乳动物细胞并在动物活体内正确表达;通过CCK-8淋巴细胞增殖实验、细胞内染色及流式细胞术(FCM)、ELISPOT实验、体外特异性细胞毒CTL-LDH释放实验分析疫苗诱导的短期及记忆性免疫应答和其介导的CTL毒性效应。结果当r=2.0时所制备的颗粒为类圆形,大小均匀一致,绝大部分颗粒直径均分布于20~80 nm之间;该纳米颗粒可将mGM-CSF基因导入哺乳动物细胞,并可在体外培养细胞和小鼠体内正确表达。该纳米颗粒疫苗在体外和体内均很大程度上提高了抗原表位特异性的免疫原性,可诱导T淋巴细胞增殖、分化,显著增强抗原特异性CTL应答及其产生的细胞毒效应。结论我们在本研究中设计并合成的Tat-E7/pGM-CSF纳米颗粒疫苗,通过体外免疫学研究证实了其具有良好效果,其机制可能是该颗粒疫苗的免疫可以维持高水平的特异性CD8^+记忆T细胞。

人乳头瘤病毒16E7限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的穿膜肽疫苗设计及体外免疫学研究

目的:利用穿膜肽人免疫缺陷病毒(HIV)-Tat49-57的穿膜能力,设计穿膜肽人乳头瘤病毒(HPV)16E7限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位(第49～57位氨基酸)的融合肽疫苗,并在体外研究其诱导特异性CTL的应答能力。方法:应用多肽固相合成技术,分别合成含HIVTat49-57和人类白细胞抗原(HLA)-A2.1限制性CTL优势表位HPV16E749-57的18肽,和该CTL表位的9肽,并用一无关肽作对照,在体外用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验分别检测了上述18肽和9肽在HLA-A2阳性健康者外周血单个核细胞(PBMC)中诱导的表位E749-57的特异性CTL活性。结果:经质谱分析,上述多肽成功合成,纯度均在95%以上。与9肽相比,18肽能在体外诱导出明显增强的特异性CTL活性(P<0.05)。结论:在HPV16E7HLA-A2.1限制性CTL表位(49～57)的N-末端加上HIV-Tat49-57序列,不会影响表位的提呈效率,而且在体外能有效激发针对E749-57特异性的CTL应答,为新型抗肿瘤及细胞内感染的多肽疫苗设计提供了新思路。