掌叶覆盆子HMGR基因家族的鉴定及表达分析

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是药用植物萜类产物骨架生物合成的重要酶之一。为了明确掌叶覆盆子HMGR蛋白的功能,使用生物信息学手段对RcHMGR家族成员的分类、基因结构、染色体定位、启动子信息等进行了系统分析,并比较了不同组织、果实不同成熟阶段及MeJA处理下RcHMGR基因的表达量。结果表明,RcHMGR基因家族共有7个成员,分布于3条染色体上,编码444~601 aa蛋白序列。RcHMGR蛋白分为4个亚家族,亚细胞定位于内质网,均含有HMGR保守功能域。RcHMGR家族基因的启动子上包含激素响应、光响应和低温响应等多种顺式元件。RcHMGR家族基因在掌叶覆盆子不同组织、果实不同成熟阶段和MeJA处理下的表达量均存在显著差异,其中RcHMGR5在果实中高丰度表达,并受到MeJA强烈诱导,与类胡萝卜素在掌叶覆盆子果实中的积累规律相一致,推测是类胡萝卜素合成途径的关键酶。上述结果为后续研究RcHMGR基因家族在萜类生物合成中的功能奠定了基础。

棉花GhHMGR基因在胚珠生长发育过程中的功能

采用植物基因工程技术,选用CaMV35S组成型启动子驱动棉花3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶基因GhHMGR在棉花中表达,检测10 DPA(days post anthesis)棉花胚珠内HMGR(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase)酶及可溶性糖、脂质及蛋白质含量,同时进行了胚珠离体培养。结果显示,Gh HMGR在棉花光照部位(叶柄和铃壳)表达量相对较高,非光照部位(根及胚珠)表达量低;超量表达GhHMGR可部分恢复拟南芥hmgr突变体性状;相较野生型,超量表达株系10 DPA胚珠的HMGR含量升高,反义株系则降低;且超量表达株系总脂质及蛋白含量升高,可溶性总糖含量降低,反义株系则出现相反结果;HMGR竞争性抑制剂洛伐他汀处理会导致胚珠发育畸形。以上结果表明,GhHMGR基因在棉花胚珠生长发育过程中扮演重要角色。

雷公藤hmgr基因克隆、序列分析及诱导表达

【目的】克隆雷公藤萜类生物合成途径限速酶HMGR的编码基因,并分析雷公藤叶悬浮细胞中该基因在不同质量浓度壳寡糖诱导下的表达水平,为雷公藤萜类生物碱的生物合成提供理论依据。【方法】根据GenBank中报道的限速酶HMGR的编码基因序列合成简并引物,采用RT-PCR、5′-RACE和3′-RACE方法从雷公藤叶片中获得hmgr基因的cDNA全长序列;用生物信息学方法对限速酶HMGR进行蛋白结构及功能分析;用半定量RT-PCR方法比较hmgr基因在不同质量浓度壳寡糖诱导下的表达差异;用HPLC分析不同质量浓度壳寡糖诱导下雷公藤叶悬浮细胞中3种萜类次生代谢物(内酯醇、吉碱和次碱)的含量。【结果】获得了雷公藤中编码限速酶HMGR的基因全长cDNA序列,该序列开放阅读框长为1 860bp,编码579个氨基酸。生物信息学分析表明,雷公藤hmgr基因编码的蛋白分子质量为61.678ku,等电点为6.98,蛋白质稳定性参数为41.33,为不稳定蛋白质,氨基酸序列包含2个与NADPH结合的位点(DAMGMNM和VGTVGGGT)及2个与HMG-CoA结合的位点(EMPVGYVQIP和TTEG-CLVA)。半定量RT-PCR结果表明,经50mg/L壳寡糖诱导12h的雷公藤叶悬浮细胞中hmgr基因表达最强,且在该诱导条件下细胞中的内酯醇、吉碱和次碱的含量也有不同程度的提高。【结论】雷公藤HMGR蛋白可能为甲羟戊酸(MVA)途径中的限速酶,编码该蛋白的hmgr基因可促进雷公藤萜类物质的合成。

刺五加HMGR基因的克隆与表达分析

根据已报道的人参HMGR(3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶)基因cDNA序列设计引物,利用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加HMGR基因的全长cDNA序列。运用生物信息学方法对该基因进行分析。通过RT-PCR法检测HMGR在刺五加不同生长发育时期和不同器官中的表达情况。结果克隆到长度为2 217 bp的刺五加HMGR基因cDNA序列,开放阅读框全长1 713 bp,编码570个氨基酸残基,包含HMGR家族的特异性识别序列。HMGR蛋白存在2个跨膜区域。RT-PCR结果显示,刺五加HMGR基因在各生长发育时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异,其中萌芽期的表达量最高,盛花期最低;各器官中,幼茎中表达量最高,是根中的1.58倍。

橡胶草HMGR基因的克隆及表达分析

通过比较9种植物的9条甲羟戊酸途径关键酶3-羟基-3甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)氨基酸同源区域,设计简并引物,利用RT-PCR和RACE技术首次从橡胶草(Taraxacum kok-saghyz)中克隆了一个HMGR基因,命名为TKHMGR。通过氨基酸序列同源性比对与系统进化分析表明,TKHMGR属于HMGR基因家族的新成员。同时,利用荧光定量方法分析了该基因在不同组织的表达情况。

简并引物的程序化设计与荔枝HMGR基因片段的克隆

主要介绍了利用NCBI、DDBJ、Blockmaker、CodeHop和Oligo6.0等数据库和生物软件进行简并引物设计的方法。利用设计的6对简并引物进行RT-PCR,从荔枝(LitchichinensisSonn.)果实中克隆到2个长度分别为510bp和582bp的cDNA片段。通过Blastx检索Genbank进行同源性比对后,发现2片段都与其它植物的HMGR基因具有较高的氨基酸序列同源性。研究表明,该程序化设计的简并引物可信性强,阳性率高,能迅速得到满意结果。

人参HMGR基因的克隆与序列分析

以人参根RNA为模板,根据其他植物HMGR基因序列保守区设计特异性简并引物,进行RT-PCR扩增。纯化回收HMGR基因RT-PCR产物与pMD18-T载体连接,再转化到JM109大肠杆菌中进行克隆,对阳性克隆菌重组质粒进行测序和序列分析。结果表明:人参HMGR核心片段的大小为458bp,与其他植物核苷酸序列有较高的同源性,依次为杜仲86.1%、南京椴83.8%、长春花83.2%、马铃薯82.5%、苹果82.1%、景烈白兰81.6%、肾叶橐吾81.6%、南苍术81.0%、红豆杉80.4%、水稻80.3%。

马铃薯HMGR基因的克隆、序列分析及其表达特征

采用RT_PCR技术 ,从马铃薯 (SolanumtuberosumL .)幼叶中克隆了一个约 1.0kb的cDNA片段 ,序列分析结果表明 ,该cDNA与已报道的马铃薯HMGR基因家族的三种类型基因具有较高核酸序列同源性 ,与HMGRⅠ基因同源性为 77.0 % ,HMGRⅡ基因为 93.2 % ,HMGRⅢ基因为 77.1%。其中 3′端非翻译区序列与HMGRⅠ、HMGRⅡ、HMGRⅢ三种基因同源性分别为 5 0 .2 %、80 .3%和 5 0 .7% ,因此推测该cDNA片段为HMGR基因家族中HMGRⅡ亚基因家族新发现的成员之一 ,命名为HMGR_c2。以特异探针进行的Southern杂交结果初步证明 ,HMGR_c2基因至少以两个以上拷贝形式存在于马铃薯基因组中 ;Northern杂交分析表明 ,HMGR_c2基因的全长mRNA约为 2 .0kb。定量RT_PCR分析表明 ,HMGR_c2基因在根、茎、叶等组织中均有表达 ,且在叶片表达量最高 ,约为根、茎的两倍。

添加α-亚麻酸对产蛋鸡内分泌激素和肝脏HMGR的影响

本试验旨在探讨日粮中添加4.0%α-亚麻酸(ALA)对罗曼粉壳蛋鸡脂质代谢的影响。采用单因素试验设计,设基础日粮(不添加ALA,对照组)和添加4.0%ALA两个处理,每个处理组设5个重复,每个重复10只24周龄罗曼粉壳蛋鸡。试验期28 d。结果表明,与对照组相比,添加4.0%ALA的处理组蛋鸡血清胰岛素增加极显著(P<0.01),雌二醇第2周增加显著(P<0.05);肝脏HMGR酶活显著下降(P<0.05),HMGR mRNA表达丰度下降(P>0.05),甘油三酯(TG)极显著下降(P<0.01)。本研究表明,添加4.0%ALA可通过改变内分泌激素、肝脏HMGR酶活、基因表达和TG来调节产蛋鸡的胆固醇代谢。

秦艽HMGR基因家族的克隆及序列分析

研究克隆了秦艽3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)家族成员的两条基因,并对其序列进行了生物信息学分析.结果显示,两条HMGR基因都包含完整的开放读码(ORF)框,编码蛋白含有HMGR蛋白特有的4个保守的活性位点,与其他植物HMGR蛋白序列具有较高的一致性,都具有跨膜结构域,高级结构类同;GmHMGR1和GmHMGR2分别定位于细胞质膜和线粒体中.表达分析显示,GmHMGR1主要在根和花中表达,而GmHMGR2主要在叶中表达.

尾巨桉HMGR基因的克隆及表达分析

基于RACE技术克隆得到尾巨桉3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(EuHMGR)基因全长为1955bp,包含1560bp的开放阅读框(ORF),编码519个氨基酸。生物信息学分析表明EuHMGR包含两个HMG-CoA结合基序和两个NADP(H)结合基序;同源建模得到EuHMGR三维构象呈"V"型,包含N-结构域、S-结构域和L-结构域。将EuHMGR组DNA与cDNA序列进行比对表明EuHMGR存在一个319bp的内含子。通过实时定量PCR进行组织特异性表达分析表明EuHMGR在茎中的表达量最高,叶次之,在根中基本无表达。该研究为后续尾巨桉EuHMGR的功能验证以及遗传转化奠定基础。

甜瓜HMGR基因全长cDNA的克隆及序列分析

根据已报道的reticulatus甜瓜的HMGR cDNA序列设计合成引物,应用RT-PCR技术从甜瓜品种河套蜜瓜幼果总RNA中克隆得到HMGR的全长cDNA序列,共1 939 bp,编码588个氨基酸。序列比对及系统发育分析表明,该HMGR cD-NA序列与已报道的reticulatus甜瓜HMGR基因cDNA序列完全一致,和拟南芥HMG1亲缘关系最近。该基因的克隆为研究该基因在甜瓜中的表达特性及其功能奠定基础。

阳春砂HMGR和DXR在烟草中单独及共同过量表达调控萜类化合物的生物合成

目的:HMGR和DXR分别是萜类生物合成途径——MVA和MEP途径的关键酶,本研究探讨阳春砂AvHMGR和AvDXR在转基因烟草中的过量表达对不同萜类化合物生物合成的影响。方法:采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析AvHMGR和AvDXR的表达水平,应用专一底物法测定HMGR和DXR的酶活性,利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术检测不同萜类化合物的变化。结果:AvHMGR或AvDXR单独过量表达抑制了HMGR和DXR的活性,提高了五针松烯、新植二烯、薄荷烯和甾醇的含量;而AvHMGR和AvDXR共同过量表达对不同植株中酶活性的影响有差异,提高了甾醇和植醇的含量,但抑制了新植二烯的积累。结论:AvHMGR和AvDXR单独或共同过量表达对烟草中不同萜类化合物的合成调控存在差异,同时也证明了MVA和MEP途径并不完全独立,而是有着相互交流,本研究为利用阳春砂AvHMGR和AvDXR进行萜类化合物的代谢调控提供了依据。

不同花色甘草种质的质量分析及其HMGR基因特征研究

在甘草群体中发现了不同花色的甘草种质,将其定义为白花类型和紫花萼类型。利用HPLC方法对不同花色种质进行了药用活性成分含量测定,发现白花和紫花萼类型的甘草酸、甘草苷和异甘草素含量均高于普通花色类型。对白花类型和紫花萼类型的两个甘草酸含量不同植株的HMGR基因特征分析结果表明,两者在HMGR部分DNA水平上存在碱基差异。

浙贝母HMGR基因保守区序列的克隆及生物信息学分析

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）是甲羟戊酸途径中的第一个限速酶,在植物生物碱类物质代谢过程中发挥重要的作用。为探究HMGR酶在浙贝母甾体类生物碱合成代谢途径中的调控作用,以百合科浙贝母狭叶品种为材料,利用RT-PCR技术和Ta克隆技术首次从浙贝母中克隆出HMGR基因保守区序列,长度为390 bp。序列分析表明,浙贝母HMGR基因保守区序列与其他9种植物的HMGR基因有较高的相似性（84%-79%）;蛋白质同源比对、特征区及系统进化树分析表明,浙贝母HMGR氨基酸片段与其他植物有较高的同源性（95%-88%）,与球药隔重楼和海枣等单子叶植物的亲缘关系较近,据此,初步确定该基因为浙贝母HMGR基因,命名为Ft HMGR。Ft HMGR基因的克隆及分子鉴定为进一步解析该基因在浙贝母甾体类生物碱合成代谢途径中的分子调控作用奠定了基础,有助于对浙贝母活性物质的合成进行调控,从而提高产量。

生姜辛香物质合成途径关键基因ZoHMGR的克隆及表达

为探明3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)在生姜(Zingiber officinale Roscoe)倍半萜合成途径的调节作用,根据在竹根姜转录组数据库中HMGR不同转录本序列,经比对分析后利用RT-PCR技术克隆HMGR基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;再利用荧光定量PCR技术检测目的基因在竹根姜不同组织和叶组织在不同诱导条件下的表达特性,同时分析其生成的倍半萜物质。结果表明:克隆的竹根姜ZoHMGR基因编码562个氨基酸,其与姜科植物阳春砂的亲缘关系最近。ZoHMGR基因主要在根茎中表达,其次是叶,而茎和根中的表达量最低,符合生姜不同组织中倍半萜物质的含量特征;该基因同时受物理伤害和茉莉酸甲酯处理的诱导,分别在6h和12h达最高表达水平,同时有倍半萜类物质生成。

31种药用植物HMGR蛋白的生物信息学分析

利用生物信息学方法对大戟(Euphorbia pekinensis)、曼地亚红豆杉(Taxus media)、球药隔重楼(Paris fargesii)等31种药用植物HMGR蛋白质的理化性质、亲/疏水性、跨膜结构、蛋白质二级结构、信号肽等进行预测和分析。结果表明,31种药用植物HMGR蛋白氨基酸残基数量大部分在500~600 aa之间;大多数定位于质膜上;分子质量在58~65 ku之间;主要富含Gly、Ala、Leu、Ser和Val等氨基酸。HMGR蛋白具有一定的亲水性,含有两个跨膜结构域,均不具有信号肽,二级结构的主要构件为α-螺旋和不规则卷曲。曼地亚红豆杉、罗汉果、假马齿苋、苍术、秦艽、土沉香、丹参、银杏、黄花蒿HMGR蛋白为稳定蛋白,而其余均为较不稳定蛋白。同源性分析表明,除了灵芝以外,其他植物均聚集在同一枝上,药用植物HMGR蛋白有较高的保守性。

茶树HMGR蛋白的生物信息学分析

为开展茶树3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(Cs HMGR)蛋白的酶学特性和萜类生物合成的分子机制研究奠定基础,采用生物信息学方法对Cs HMGR蛋白的理化性质、结构特征、功能及系统演化关系等进行了预测分析。结果表明:2个茶树蛋白(Cs HMGR1和Cs HMGR2)均为疏水性蛋白,主要由α-螺旋和无规则卷曲组件构成二级结构;三级结构以同源四聚体形式存在,含有HMGR蛋白特有并保守的2个HMG-CoA结合域和2个NADP(H)结合域;Cs HMGR1与拟南芥At HMGR1的遗传距离最近,Cs HMGR2与烟草、番茄的遗传距离较近。

猪HMGR基因组织表达特性研究

为了解猪HMGR基因的组织表达特点和规律,本研究通过RT-PCR半定量和Real-timePCR方法,检测猪HMGR基因在各组织中的表达。结果表明:猪HMGR基因在检测的15种组织中均表达,在各组织中的相对表达量高低依次为肝脏>心脏>肾脏>膀胱>皮下脂肪>肺脏>子宫>大肠>大脑>脾脏>脊髓>胃>卵巢>背最长肌>小肠。HMGR在肝脏中最高表达,为"肝脏是胆固醇合成的主要场所"这一观点提供了佐证。此外,HMGR在心脏、肾脏和膀胱中也有较高水平表达,说明该酶也在这些组织中起重要作用,但作用机理需进一步加以验证。

橡胶HMGR蛋白的生物信息学分析与同源模建

利用生物信息学方法分析了橡胶HMGR蛋白的氨基酸组成、等电点、疏水/亲水区、二级结构等蛋白质性质,并同荔枝、拟南芥和水稻的蛋白进行了对比,并用生物信息学软件对其空间结构进行了模拟,同时对模建结果进行了结构质量的分析与检测。结果表明:该蛋白共有575个氨基酸,等电点为6.44,二级结构中α螺旋占45.91%,β折叠片占13.04%,无规卷曲占35.83%。三维结构检测表明,此模型的结构符合立体化学规则。此外,利用该模型预测了配体SIM和ADP在HMGR结构空间的近似位置,并定位了与SIM和ADP作用的相关残基。