鸡新城疫病毒HN基因亚单位疫苗诱导免疫保护的实验研究

实验分别将应用Ｂａｃ ｔｏ Ｂａｃ系统表达的新城疫病毒四平株和长春株血凝素－神经氨酸酶基因（ＨＮ基因）蛋白的重组杆状病毒感染Ｓｆ－９昆虫细胞后，２８ ℃培养７２ ｈ后，洗涤、收集昆虫细胞，离心浓缩，－２０ ℃冻融３次。用ＨＡ－ＨＩ实验和ＨＮ单抗中和试验测定表达产物的活性。将表达的重组蛋白作为亚单位疫苗免疫鸡。用间接ＥＬＩＳＡ和ＨＩ试验测定鸡体内抗体效价。免疫后第１５ ｄ用国家标准强毒ＮＤＶ Ｆ４８Ｅ８攻毒，统计免疫保护率。结果表明，表达的ＮＤＶ ＨＮ重组蛋白能够诱导鸡体产生抗ＮＤＶ 特异性ＩｇＧ抗体和ＨＩ抗体。实验Ⅰ组（四平株）雏鸡保护率为６５％，实验Ⅱ组（长春株）雏鸡保护率为１００％。

定位表达的新城疫病毒HN蛋白对荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫作用

背景与目的新城疫病毒HN蛋白是新城疫病毒产生溶瘤作用的重要免疫原。在前期体外实验基础上,比较定位表达细胞不同部位的HN蛋白体内抗肿瘤免疫作用。方法通过构建荷瘤小鼠,瘤内注射定位表达于细胞不同部位的新城疫病毒HN蛋白,即胞浆型(Cy-HN)、跨膜型(M-HN)、分泌型(Sc-HN)重组真核表达质粒,比较荷瘤小鼠的肿瘤生长速度,脾淋巴细胞增殖反应和细胞毒T细胞活性。结果瘤内注射跨膜型重组真核表达质粒的荷瘤小鼠肿瘤生长缓慢,与瘤内注射胞浆型和分泌型重组真核表达质粒的荷瘤小鼠相比有统计学差异(第18天:P=0.022;第21天:P<0.01),同时,该组荷瘤小鼠的淋巴细胞增殖反应和细胞毒T细胞活性也较高[M-HNvsCy-HN,P=0.019;M-HNvsSc-HN,P=0.043;M-HNvspcDNA3.1(+),P<0.01]。结论定位表达于细胞不同部位的HN蛋白体内抗肿瘤免疫作用存在差异,跨膜型HN蛋白的重组DNA质粒能够提高荷瘤小鼠的特异性细胞免疫应答。

新城疫病毒四平株HN蛋白基因的克隆与序列分析

新城疫病毒 (NDV)四平株在鸡胚增殖后纯化 ,提取RNA ,然后利用特异性引物 ,经RT_PCR一次性扩增出了NDV四平株的全长HN基因。将该HN基因插入pKS(_)后测序。序列分析表明 ,该HN基因核苷酸长度为 1 742bp ,编码 5 71个氨基酸 ,序列中有 5个糖基化位点 ,1 2个半胱氨酸残基。同源性分析表明 ,四平株HN基因与目前国外发表的其他NDVHN基因相比 ,核苷酸序列同源性在 83.4%_89.2 %之间 ,推导的氨基酸序列同源性在 87.6 %_91 .1 %之间。

10株新城疫病毒广西分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析

根据基因库(GenBank)新城疫病毒(NDV)的HN基因序列设计了2对特异性引物,应用RT-PCR技术对广西在2000～2003年暴发新城疫的鸡群中分离的10株NDV毒株的HN基因进行了扩增,扩增产物克隆并测序,拼接出10个NDV广西分离株的HN基因全序列,其序列全长均为1 713 bp,编码571个氨基酸,均有13个半胱氨酸残基.其中GX8/03有6个糖基化位点,而GX2/00、GX6/02、GX7/02和GX5/00有5个糖基化位点,GX1/00、GX3/00、GX4/00和GX9/03有4个糖基化位点.除GX5/00和GX10/03分离株外,其他8个NDV分离株在HN基因抗原位点Ⅰ发生变异,即347位由谷氨酸(E)被甘氨酸(G)替代,GX8/03分离株在HN基因抗原位点Ⅱ的495位由赖氨酸(K)替代谷氨酸(E).与11株已发表的NDV HN基因全序列相比较,其核苷酸同源性在79.6%～ 97.9%之间,推导的氨基酸同源性在87.2%～98.1%之间.

NDV长春株生物学特性及与国外毒株HN蛋白基因的同源性比较

以新城疫病毒 ( NDV)长春株接种 9日龄 SPF鸡胚增殖后 ,进行了蚀斑纯化 (三代 )鉴定 ,差数、蔗糖密度梯度离心提纯和生物学特性鉴定。结果表明 ,该病毒的鸡胚平均致死时间 ( MDT)大于 1 6 8h,雏鸡脑内致死性 ( ICPI)为 0 .2 5,雏鸡静脉致死性 ( IVPI)为 0 ,血凝解脱时间超过 1 2 0 h,血凝素热稳定性 56℃ 5min仍具有血凝活性。系统发育进化树分析表明 ,NDV长春株与 La Sota株亲缘关系最近 ,为弱毒株。参考多株 NDVHN基因序列设计了 1对特异性引物 ,应用 RT-PCR一次性扩增出 NDV长春株的全长 HN基因。将该 HN基因插入 p KS( -)后 ,进行了序列测定。序列分析表明 ,该 HN基因核苷酸长度为 1 731 bp,编码 577个氨基酸 ,序列中有 5个糖基化位点 ,1 2个半胱氨酸残基 ,与国外发表的 NDV毒株序列相符 ,核苷酸同源性为88.1 %～ 98.8% ,推导的氨基酸同源性为 91 .1 %～ 98.8%。

新城疫病毒HN蛋白结构及其生物学活性研究进展

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)HN糖蛋白位于病毒囊膜表面,与病毒的毒力及致病性密切相关,因此在NDV的研究中具有重要的意义。从HN蛋白的1级结构、空间结构分析了与其相应的受体结合能力、神经氨酸酶活性和促膜融合活性等生物学活性。

新城疫病毒F和HN蛋白的原核表达

目的:高水平表达新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)标准强毒F48E8株的F基因和HN基因。方法:利用PCR方法扩增出新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)标准强毒F48E8株的去掉N端信号肽和C端跨膜区的F基因和HN基因并将其克隆到原核表达载pET30a上,得到重组质粒rpET30a-NDV/F和rpET30a-NDV/HN,转化到受体菌Rosetta-gamiTM2感受态细胞中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot检测。结果:表达的F蛋白大小约为40kD,HN蛋白大小约为51kD左右,符合预期结果。Western blot分析表明,能与抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应。结论:重组蛋白在原核表达系统内得到了高水平的表达。说明了去除F和HN基因N端信号肽和C端跨膜区的必要性。

新城疫病毒昌黎株与国外毒株HN蛋白基因核苷酸及氨基酸差异性分析

参考国外发表的新城疫病毒 ( NDV)的 HN基因序列设计了 1对特异性引物 ,应用 RT-PCR对 NDV昌黎株 (野毒 )的 HN基因进行了扩增 ,扩增产物克隆后测序。扩增出的 HN基因核苷酸长度为 1 74 2 bp,编码 571个氨基酸 ,序列中有 6个糖基化位点 ,1 3个半胱氨酸残基 ,与国外发表的强毒株序列相符。核苷酸同源性在 88.5%～ 92 .9%,推导的氨基酸序列同源性在 90 .0 %～ 94 .2 %之间。

置换HN基因对新城疫病毒LaSota株致病力的影响

【目的】新城疫病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合蛋白(F)在病毒装配、出芽、释放及侵入宿主细胞的过程中发挥关键作用,但HN对病毒致病力的影响程度尚不完全清楚。【方法】为探讨这一问题,本研究以中等毒力毒株Mukteswar的HN基因替换我国广泛应用的LaSota疫苗株HN基因,通过反向遗传操作技术拯救出嵌合病毒(rL-MuHN)。【结果】rL-MuHN红细胞吸附能力较亲本株rLaSota无显著升高,具有相似的细胞融合活性;嵌合病毒ICPI由rLaSota株的0.36降为0,MDT≥90,IVPI=0与rLaSota株相同,保持典型低致病力缓发型特点不变。进一步以Mukteswar株F基因替换rL-MuHN的F基因,拯救出F和HN双基因替换嵌合病毒rL-MuFHN,尽管该病毒的细胞融合能力显著提高,但其MDT、ICPI和IVPI分别为98h,0.59和0,显示F和HN双基因替换仍未能使嵌合新城疫病毒rL-MuFHN的致病力达到中等毒力毒株Mukteswar(MDT、ICPI及IVPI分别为46h、1.32和0.64)的水平。【结论】试验结果表明,F及HN囊膜蛋白基因之外的病毒基因组骨架背景对病毒的致病性同样具有重要的决定性意义,不同HN蛋白对嵌合病毒的致病能力的影响不同,与供体毒株毒力无关;以流行野毒株HN替代rLaSota疫苗株构建抗原针对性更强的弱毒疫苗株存在技术可行性。

新城疫病毒HN蛋白球状头部在T4噬菌体衣壳表面的展示

用RT-PCR扩增新城疫病毒(NDV)hn基因,得到大小约1700bp的片段,将其克隆至pGEM-Teasy载体并测定其核苷酸序列。根据测序结果,另设计1对引物带有EcoR限制位点,用PCR扩增基因主要功能区即编码HN蛋白球状头部的hngd片段,将其分别克隆至pSOC和pR质粒soc基因3′端,重组质粒pSOC-HNGD转化E.coliBL-21(DE3)感受态细胞,以终浓度1mmol/L的IPTG诱导表达,在SDS-PAGE凝胶上检测到相对分子质量大小约67000的目的蛋白条带。随后将重组质粒pR-HNGD转化T4宿主菌E2感受态细胞,阳性克隆用溶菌酶缺陷的T4-Z1感染,用不加溶菌酶的SC平板筛选阳性克隆。经PCR鉴定,hngd片段已整合在T4-Z1的基因组中。纯化后的重组噬菌体T4-Z1-HNGD用SDS-PAGE和Western-blot可检测到67000的特异条带。结果表明,HNGD蛋白成功展示在T4噬菌体衣壳表面,且与NDV抗血清具有良好的反应性。

用重组HN蛋白建立新城疫抗体检测的ELISA方法

用T4噬菌体表达的重组新城疫病毒HN蛋白(rHN)为包被抗原,建立新城疫抗体检测的酶联免疫吸附实验(rHN-ELISA).结果表明,抗原最适包被浓度为1.6μg/100μL,待检血清最适稀释度为1:80,鸡血清样品的光吸收值OD450大于0.126可判定为阳性结果,而SPF鸡血清,非免疫鸡血清以及MD,IBD,IB,ILT,AI阳性血清的检测结果均为阴性.对批内和批间样品重复检测的变异系数分别为3.7%～8.5%和3.1%～7.4%.人工感染NDV的SPF鸡第3 d即可用rHN-ELISA检测到抗体,灵敏度明显高于HI和AGP试验.因此,rHN-ELISA是1种特异、敏感、快速的ND抗体检测方法.

新城疫病毒HN融合蛋白对马立克肿瘤细胞MDCC-MSB1凋亡的影响

为研究新城疫病毒HN融合蛋白抗肿瘤细胞的作用机制,以马立克病肿瘤细胞系MDCC-MSB1为体外研究对象,将HN融合蛋白与MDCC-MSB1细胞共培养后,应用CCK-8法检测HN融合蛋白对肿瘤细胞的增殖抑制作用,用琼脂糖凝胶电泳分析DNA断裂程度,用流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡情况。结果表明,HN融合蛋白对MDCC-MSB1肿瘤细胞的增殖有抑制作用,并呈时间、剂量依赖性;DNA出现断裂现象;MDCC-MSB1细胞出现凋亡。证实,HN融合蛋白体外可诱导MDCC-MSB1肿瘤细胞凋亡。

抗新城疫病毒HN蛋白单抗可变区基因的克隆与序列分析

提取抗新城疫HN蛋白单克隆抗体C3-B7杂交瘤细胞总RNA,进行RT-PCR,扩增出轻重链可变区基因。凝胶回收纯化后与pMD-18T载体连接,重组载体转化于宿主菌DH5α,筛选出阳性重组子,菌液PCR鉴定后进行测序。结果显示,VH基因全长357 bp,编码119个氨基酸;VL基因全长332 bp,编码110个氨基酸。这为单链抗体的构建及表达奠定了基础。

昆虫细胞表达基因ⅦNDVHN基因的免疫效力研究

利用杆状病毒表达系统对ⅦNDV HN基因进行表达研究。RT-PCR扩增HN基因,将其克隆到p Fast Bac HT A载体中,阳性重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得含HN基因的重组杆状病毒质粒,重组病毒感染Sf9细胞72 h后,进行SDS-PAGE电泳、间接免疫荧光和Western-blot试验。免疫SPF鸡,间接ELISA测定抗体滴度,攻毒保护试验检测重组HN蛋白保护性。结果显示,目的蛋白HN在昆虫细胞中有特异性表达,该蛋白诱导了高滴度的NDV特异性抗体,具有良好的免疫原性;强毒攻击保护率达到75%,与La sota疫苗组保护率接近,均明显高于阴性对照组。上述结果为NDV新型亚单位疫苗奠定了基础。

新城疫病毒HN基因的截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立一种快速的新城疫病毒(NDV)抗体检测方法,参照已发表的NDV基因组序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增了长约1044bp的HN基因片段。将目的片段定向克隆到pGEX-6p-1原核表达载体,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测新城疫病毒抗体的间接ELISA诊断方法。该方法批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与血凝抑制试验(HI)相比较,符合率、敏感性和特异性分别为92.0%、91.0%和93.6%。

鹅副粘病毒GX1株的HN和F蛋白基因的克隆和序列分析

[目的]克隆鹅副粘病毒GX1株HN基因与F基因，并进行序列分析。[方法]根据Genbank已发表的鹅副粘病毒GPV—SF02株基因组核苷酸序列设计2对引物，对从广西发病鹅分离到的鹅副粘病毒毒GX1株的HN和F基因进行PCR扩增，将扩增产物与pMD18-T载体连接并测序。[结果]该株副粘病毒株的HN基因和F基因核苷酸序列全长分别为1716和1662bp，与GPV—SFO2株的同源性均在97．3％左右，与LaSota株、F48E9株、JS株的同源性为80．3％～97．5％，与Miyadera株的同源性仅84．8％。[结论]分离株GX1株与禽Ⅰ型副粘病毒（APMV-1）强毒株特征相符，属于APMV-1基因Ⅶ型。

新城疫病毒xx08株HN蛋白主要抗原区的原核表达及其在抗体检测中的应用

为建立检测新城疫病毒(NDV)抗体的间接ELISA方法,构建了新城疫(ND)xx08株HN基因抗原表位集中区基因片段的重组表达质粒p ET28a-r HN,加入IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE鉴定表明,表达的重组蛋白大小约为28 ku。Western blot分析表明,该重组蛋白具有良好的反应性。以纯化的HN蛋白为包被抗原建立检测NDV抗体的间接ELISA方法,优化试验条件后,抗原最适包被浓度为5μg/m L,血清最适稀释比例为1∶80,与HI试验结果符合率较高,且与鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病(IBV)、鸡禽流感病毒(AIV)和鸡马立克氏病毒(MDV)等标准阳性血清无交叉反应。表明建立的间接ELISA方法可以用于临床新城疫抗体的检测。

重组新城疫病毒HN与F蛋白免疫保护作用的初步研究

95只1日龄SPF鸡随机分成5组,1～4组分别于10日龄接种ΦT4、ΦT4-Z1-HN、ΦT4-Z1-F、ΦT4-Z1-HN+ΦT4-Z1-F油乳剂疫苗,第5组接种ND弱毒疫苗,25日龄加强免疫一次。结果表明,重组HN和F蛋白均能诱导ND抗体产生,但抗体水平显著低于用弱毒疫苗免疫的第5组。60日龄时用100LD50NDV强毒株攻毒,第1组鸡100%发病和死亡,ΦT4-Z1-HN和ΦT4-Z1-F免疫组的死亡率分别为50%和15.8%;用ΦT4-Z1-HN+ΦT4-Z1-F和ND弱毒疫苗免疫的第4、5组鸡无一死亡。

鹅副粘病毒GX1株的HN和F蛋白基因的克隆和序列分析

1材料与方法 1．1病毒来源鹅副粘病毒分离株GX1株由广西壮族自治区动物疫病预防控制中心实验室分离保存。 1．2试剂及仪器各种PCR反应试剂、PMD-18T载体、胶回收试剂盒、限制性内切酶等均购自宝生物工程（大连）公司。仪器：恒温孵化箱、PCR反应仪、超速离心机、移液器等。

鸡新城疫病毒Lasota株HN蛋白主要抗原表位基因在大肠杆菌中的表达

用RT—PCR法从NDV Lasota疫苗株中扩增出HN基因，将其克隆到pGEM—T easy vector中，构建了重组质粒pT—HN．设计了1对引物，用PCR法扩增出HN蛋白主要抗原表位基因（442—1734bp共1239bp），将其连接到原核表达载体pET-28a（＋），构建重组质粒pET—HN．用IPTG诱导使其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达．SDS—PAGE结果表明，NDV HN主要抗原表位基因在pET—HN中获得了高效融合表达，其表达蛋白的分子量为28kD．同时，通过试验摸索并确定了表达HN蛋白主要抗原表位基因的最佳诱导条件：IPTG终浓度为0．4mmol·L^-1，诱导时间为4h，温度为37℃．