利用CRISPR/Cas9慢病毒系统敲除人源HOIP基因

泛素化修饰是一种能调节诸多细胞功能的重要蛋白质翻译后修饰,近几年研究发现了一种新的泛素化修饰即线性泛素化修饰,LUBAC(linear ubiquitin chain assembly complex)是目前已知唯一的导致蛋白质发生线性泛素化修饰的E3酶。目前LUBAC复合物的底物和功能所知甚少。为了探索LUBAC复合物新的底物和功能,利用CRISPR/Cas9慢病毒系统构建稳定敲除LUBAC核心组分HOIP基因的HeLa细胞系,通过质谱鉴定此细胞系和对照细胞的差异泛素化修饰蛋白质,即可能是LUBAC新的底物。首先将靶向HOIP基因的不同CRISPR序列插入lenti CRISPRv2载体中,制备慢病毒质粒感染He La细胞,然后使用嘌呤霉素压力筛选,用Western Blot方法检测HOIP基因的敲除效果,最后成功地构建HOIP基因稳定敲除HeLa细胞系。此稳定细胞系的构建为日后深入研究LUBAC的功能提供一个人类细胞模型。

线性泛素化修饰研究进展

蛋白质泛素化修饰过程在调节各种细胞生物学功能的过程中发挥了非常重要的作用,如细胞周期进程、DNA损伤修复、信号转导和各种蛋白质膜定位等。泛素化修饰可分为多聚泛素化修饰和单泛素化修饰。多聚泛素化修饰系统可以通过对底物连接不同类型的多泛素化链调节蛋白质的功能。多聚泛素化修饰中已知7种泛素链连接方式均为泛素内赖氨酸连接方式。近几年发现了第8种类型的泛素链连接形式即线性泛素化,其泛素链的连接方式是由泛素甲硫氨酸的氨基基团与另一泛素甘氨酸的羧基基团相连形成泛素链标记。目前研究表明线性泛素化修饰在先天性免疫和炎症反应等多个过程中发挥着非常重要的作用。募集线性泛素链的泛素连接酶E3被称为LUBAC复合体,其组成底物以及其活性调控机制和功能所知甚少。本文综述了募集线性泛素化链的泛素连接酶、去泛素化酶、底物等活性调控机制及其在先天性免疫等多个领域中的功能,分析了后续研究方向,以期为相关研究提供参考。