高效液相色谱-质谱法在筛选胆管癌肿瘤标志物中的应用

目的应用蛋白质组学技术筛选人胆汁中与胆管癌相关的蛋白质分子。方法收集2008年3月至2009年10月重庆医科大学附属第一医院肝胆外科经明确病理诊断的胆管癌住院患者的胆汁共15例,正常人胆汁5例。应用非离子型脱脂剂结合分子筛超滤方法制备纯化胆汁样本,通过高效液相色谱-质谱法(HPLC-CHIP-MS/MS)鉴定差异表达的蛋白质,并用Spectrum Mill software对检测结果进行分析。结果与正常人胆汁比较,在胆管癌患者胆汁中,检测到109个高可信蛋白,其中12个为新增蛋白质,其功能主要涉及癌细胞的发生、增殖、分化、转移等。结论高效液相色谱-质谱法鉴定的12个差异表达蛋白质可能成为研究胆管癌的生物学分子标志物。

人低温离体灌注心脏心肌缺血损伤早期蛋白组学研究

目的分析离体心脏灌注早期心肌缺血损伤释放出的蛋白质组成,并探讨这些蛋白的生理学过程和功能。方法收集人离体心脏停跳后即刻、30 min和60 min后的4℃灌注液,样品首先用MARS柱去除高丰度蛋白,用10×103分子筛脱盐浓缩、溶液内酶解,得到肽段用mRP柱进一步脱盐,通过液相-芯片-离子阱质谱(HPLC-Chip-MS/MS)技术进行鉴定和生物信息学分析,建立离体心脏灌注早期心肌缺血释放蛋白全谱图,通过GO注释和EBI数据库对这些蛋白进行功能和定位分析以及BLAST比对。结果得到高可信蛋白176个(Score≥8,SPI≥70%);经GO注释分析,主要参与细胞、生物学调节、代谢等生理学过程,具有结合功能、催化活性以及酶调节活性等;通过EBI数据库对106×103未知蛋白和29×103未知蛋白进行BLAST比对发现前者是一种出胞蛋白,后者性质目前尚不明确。结论离体心脏灌注获得的176个高可信蛋白对进一步研究心肌缺血损伤早期生物学标记物具有重要的意义。106×103和29×103的2个未知蛋白可能是未发现的心肌早期缺血损伤蛋白标记物。

基于核酸适配体的微流控芯片酶反应器用于蛋白质的分析

将核酸适配体作为胰蛋白酶固定化介质,制备了一种新型的微流控芯片酶反应器,并与高效液相色谱-串联质谱联用,搭建了在线分析平台;分别使用标准蛋白及混合蛋白样品对芯片的酶解效率及联用平台的分析能力进行了初步评价。结果表明,5 ng肌红蛋白经该平台分析后肽段覆盖率可达到37%;对500 ng混合蛋白进行3次平行分析,肽段覆盖率及相对标准偏差分别为44.3%、6.5%(牛血清白蛋白),65.0%、2.7%(肌红蛋白)和62.0%、5.6%(细胞色素c);初步实验表明,该在线分析平台具有检测灵敏度高、重现性好、酶解效率高的特点,有望在蛋白质组学分析中发挥重要作用。

Jurkat T细胞质膜蛋白组学研究初探

目的:分析Jurkat T细胞质膜蛋白质组成,并对这些质膜蛋白的生理学过程和功能进行初步分析,为进一步研究Jurkat T细胞膜蛋白功能奠定基础。方法:首先采用差异密度梯度离心法提取Jurkat T细胞膜蛋白,然后将提取出的膜蛋白根据分子量大小通过SDS-PAGE进行初步分离,再进一步将分离出的蛋白条带切下进行胶内酶解,酶解后的肽段通过液相-芯片-离子阱质谱技术进行鉴定和生物信息学分析,建立Jurkat T细胞质膜蛋白全谱图,并进一步通过GO(Gene Ontology)对这些质膜蛋白进行功能分析。结果:成功提取了Jurkat T细胞的膜总蛋白,并建立了Jurkat T细胞质膜蛋白全谱图,共鉴定出618个质膜蛋白,经GO注释分析,其中与结合功能相关的质膜蛋白有493个,与信号转导活性相关的有186个,具有酶催化活性的有166个,具有转运活性的有137个,有些还具有酶调节活性、结构分子活性或者运动活性等,功能尚不清楚的有49个。结论:通过差异密度梯度离心,结合一维SDS-PAGE和HPLC-CHIP-MS/MS,成功建立了Jurkat T细胞质膜蛋白全谱图,并通过GO注释,初步分析了这些蛋白的功能和生理学过程,为进一步研究Jurkat T细胞质膜蛋白的功能奠定了基础。