HPV16 E5多表位肽免疫原性研究

目的筛选人乳头瘤病毒16型(HPV16)E5蛋白多表位肽段,并评估其诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫的免疫原性反应。方法通过Uniprot获得HPV16 E5蛋白的氨基酸序列,采用EXPASY和SYFPEITHI等软件预测HPV16 E5蛋白的表位,筛选出富含B细胞和CTL表位的氨基酸肽段——HPV16 E5蛋白N端处aa28-46(LIRPLLLSVSTYTSLIILV),进一步用该多表位肽免疫C57BL/6小鼠,评估其诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫的反应。结果该肽段可诱导小鼠产生较高水平的特异性IgG抗体,且抗体滴度随着免疫次数增加而升高,同时可诱导小鼠产生特异性的CTL反应,在效靶比为40∶1时,对靶细胞产生显著的特异性杀伤作用。结论HPV16 E5蛋白多表位肽aa28-46(LIRPLLLSVSTYTSLIILV)具有良好的免疫原性,可为基于HPV16 E5蛋白的疫苗研究提供基础。

GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位

目的研究GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位。方法 PCR扩增HPV16E5基因片段,将其连接到真核表达载体pEGFP-C1,双酶切及测序鉴定,构建表达载体pEGFP-C1/HPV16 E5;将质粒pEGFP-C1/HPV16 E5和pEGFP-C1分别转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下观察GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位。结果 GFP荧光均匀分布在细胞浆和细胞核;GFP-HPV16 E5融合蛋白组荧光分布在细胞浆。结论 GFP-HPV16 E5融合蛋白能在HeLa细胞内表达且定位于细胞浆。

湖北地区HPV16 E7和E5基因突变与宫颈病变的相关性

目的分析湖北地区宫颈病变组织中HPV16E7和E5基因序列变异及该变异与宫颈病变的相关关系。方法对HPV16E7和E5DNA阳性的20例正常宫颈、30例CINⅠ~Ⅱ、30例CINⅢ和35例宫颈鳞癌的基因片段进行纯化测序,检测基因变异。结果除了HPV16E7和E5原型序列以外,HPV16E7最常见变异为A647G和T846C的联合变异株,该联合变异株频率在正常宫颈、CINⅠ~Ⅱ、CINⅢ和鳞癌组中突变率分别为25%、30%、53.3%、62.9%;HPV16E5最常见变异为A3979C＋A4042G联合变异株,联合变异株在正常宫颈、CINⅠ~Ⅱ、CINⅢ组和鳞癌组中突变率分别为30%、33.3%、56.7%、71.4%;HPV16E7和E5联合突变株在宫颈病变各阶段差异有统计学意义。结论 HPV16E7.A647G/T846C和HPV16E5.A4042G/A3979C联合变异株为中国湖北地区宫颈病变中流行的变异株,此变异株与宫颈病变程度呈正相关。

HPV16型E5基因对人永生化口腔上皮细胞E6、E7基因表达的影响

目的:研究HPV16型E5基因对人永生化口腔上皮细胞(human immortalized oral epithelial cell,HIOEC)E6、E7基因的影响。方法:HIOEC转染pLEGFP-E5基因反转录病毒载体,同时人为突变E5基因并转染HIOEC,通过PCR检测E5及各突变体在HIOEC中的表达。实时定量PCR检测E6、E7基因mRNA水平表达量的变化以及转染后HIOEC的细胞增殖能力,采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学处理。结果:构建了E5缺失突变体反转录病毒载体并成功转染人永生化口腔上皮细胞。转染后人永生化口腔上皮细胞的增殖行为实验表明,HPV16E5基因可促进人永生化口腔上皮细胞增殖(P<0.05),并对E6、E7基因mRNA表达具有正调控作用,但其缺失突变基因反转录病毒载体对人永生化口腔上皮细胞增殖及E6、E7表达无显著影响。结论:HPV16型E5基因可在一定程度上促进人永生化口腔上皮细胞增殖,并对E6、E7基因mRNA表达量有一定的间接上调作用。

宫颈癌中HPV16E5基因的变异与病毒物理状态的研究

目的研究HPV16DNA在宫颈癌组织中的物理状态及其与E5转化基因的变异的关系。方法用斑点杂交方法确定HPV16阳性的宫颈癌标本,采用Southern印记杂交技术检测HPV16DNA在宫颈癌组织中的物理状态,并结合E5基因的扩增及序列测定来综合探求HPV16基因组在宿主细胞中的物理状态及其与E5片段变异的关系。结果60例宫颈癌组织中HPV16阳性率为58%(35/60);其中有22%(8/35)的HPV16DNA是以游离状态存在于宿主细胞内。在HPV16以游离型存在的宫颈癌标本中,仅有1例(1/8)发生了变异。结论不同病理分期的宫颈癌组织HPV16的物理状态无明显差异。在游离型HPV16致癌机制中,E5的变异似乎不占主导地位。所得结果为揭示HPV16致宫颈癌的分子机制尤其是为E5在游离型HPV16致癌机制提供了新资料。

宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E5基因的变异

探讨了HPV16E5基因突变与宫颈癌发病的关系。应用银染聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)分析对 5 0份人宫颈癌活检标本进行基因突变的筛查。PCR检测显示 ,5 0例宫颈癌组织中HPV16E5的检出率为30 % (15 / 5 0 ) ,其中 6例宫颈癌HPV16E5扩增片段在行SSCP分析时发现有泳动变位 ,突变率为 40 % (6 / 15 )。

人乳头瘤病毒16型E5转化基因的克隆及原核表达

目的建立人乳头瘤病毒16型E5基因的无性繁殖系为进一步研究其致癌机理作准备。方法用PCR技术从HPV16质粒DNA中扩增出E5基因序列连接到pGEM-T载体,将阳性的重组pGEM-T用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切并回收目的片段连接到原核表达载体pGEX-2T,转化DH5α菌株。取工程菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。结果①经PCR、测序和双酶切鉴定认为HPV16E5正确插入上述表达载体,建立了该转化基因的无性繁殖系。②经IPTG诱导的pGEX-2T-E5质粒表达出约42KD的融合蛋白,分析含有约16KDHPV16E5蛋白,与预期含HPV16E5的融合蛋白分子量相符。结论①采用PCR克隆技术,扩增HPV16E5转化基因目的片段,将其克隆到pGEM-T载体在国内首次建立了HPV16E5转化基因的无性繁殖子。②成功构建HPV16E5基因的原核表达质粒,并表达出GST-E5融合表达蛋白。

人乳头瘤病毒16型E5与IL-12联合基因疫苗的免疫活性

为了研制人乳头瘤病毒16型(HPV16)防治性疫苗,分析了HPV16 E5与IL-12联合基因疫苗的免疫活性。将构建的pcDNA3.1(+)/E5与pcDNA3.1(+)/IL-12联合免疫BALB/c小鼠,以ELISA测定小鼠血清中抗HPV16 E5 IgG水平、小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4含量;MTT法检测脾淋巴细胞增殖反应。结果显示末次免疫后,联合基因疫苗组和单基因疫苗组血清IgG A450值分别明显高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组(P<0.01);且联合基因疫苗组显著高于单基因疫苗组(P<0.01)。联合基因疫苗组和单基因疫苗组的IFN-γ和IL-4含量分别均明显高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组IFN-γ和IL-4含量(P<0.01),且联合基因疫苗组含量显著高于单基因疫苗组(P<0.01)。联合基因疫苗组和单基因疫苗组脾淋巴细胞刺激指数(SI)分别显著高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组(P<0.01);联合基因疫苗组与单基因疫苗组比较,SI差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明HPV16 E5单基因疫苗以及与IL-12联合基因疫苗均能刺激机体产生较强的免疫应答,且联合基因疫苗优于单基因疫苗。

16型人乳头瘤病毒E5基因对永生化口腔上皮细胞EGFR、p21、p53和Rb基因表达的影响

目的分析16型人乳头瘤病毒E5基因(HPV16 E5)对永生化口腔上皮细胞(HIOEC)肿瘤相关基因表皮生长因子受体(EGFR)、p21、p53和Rb表达的影响,探究HPV16 E5在口腔鳞状细胞癌发生发展过程中的潜在作用机制。方法将含有目的基因HPV16 E5的慢病毒载体p LOV-E5及对照病毒载体p LOV-N分别转染HIOEC细胞,并筛选出各自稳定转染的细胞株。RT-q PCR和Western blot法分别检测EGFR、p21、p53和Rb基因mRNA和蛋白表达水平的变化。MTT法分析HPV16 E5对HIOEC细胞增殖活性的影响。结果p LOV-E5转染的HIOEC细胞中,p21和p53的mRNA转录水平较对照组显著提高(P=0.00、0.02),但EGFR的mRNA转录水平较对照组无明显变化;EGFR、p21和p53的蛋白表达水平较对照组均显著提高,Rb基因的mRNA和蛋白表达水平较对照组均无明显变化。MTT法检测结果表明,p LOV-E5转染HIOEC的增殖活力较对照组显著提高(P=0.00)。结论 HPV16 E5可以促进HIOEC的增殖,同时上调EGFR、p21和p53在HIOEC中的表达水平。

人乳头瘤病毒E5的研究进展

人乳头瘤病毒E5是一种转化作用的癌蛋白,是细胞膜或内膜整合蛋白。人乳头瘤病毒E5在感染的细胞中表达,主要在感染细胞克隆早期的繁殖、扩张中起重要作用。它干预生长因子受体,干扰周期蛋白和周期蛋白激酶,促进病毒癌基因转化,抑制抑癌基因表达,激活启动子促进病毒繁殖,并通过多种机制促使损伤细胞,通过细胞周期,使宿主细胞增殖、分化延缓、恶性化。近年的研究揭示了不同类型人乳头瘤病毒癌蛋白的功能差异,为人乳头瘤病毒诱导细胞永生化和致癌分子机制的研究提供了依据。该文将从E5对信号转导途径的影响,对细胞周期的影响,与癌基因和抑癌基因的相互作用,反式激活作用和变异几方面综述E5的研究进展。

湖北地区宫颈癌组织HPV16 E7和E5转化基因变异分析

目的:分析湖北地区宫颈癌组织HPV16E7和E5基因序列变异情况。方法:对87例宫颈鳞癌组织分别采用多重HPV16E7引物进行巢式PCR扩增和HPV16E5特异引物进行PCR扩增,并选择阳性扩增的基因片段DNA进行纯化、测序,检测基因变异。结果:测序成功的20例宫颈癌组织DNA中,HPV16E7基因的5个突变位点为:T846C、A647G、T732C、T789C、T795G,突变频率分别为85%(17/20)、70%(14/20)、15%(3/20),10%(2/20)、5%(1/20);HPV16E5基因的4个突变位点包括:A3979C、A4042G、G3868A、C3991T,突变频率分别为:80%(16/20)、90%(18/20)、5%(1/20)、5%(1/20)。结论:湖北地区宫颈癌的宫颈组织中HPV16E7热点突变为A647G和T846C,HPV16E5的热点突变为A3979C和A4042G,本研究为湖北地区宫颈癌流行病学的研究打下基础。