浸润性宫颈癌及宫颈上皮内瘤变组织中HPV16-E7蛋白和端粒酶的表达及意义

目的探讨16型人乳头瘤病毒E7(HPV16-E7)蛋白和端粒酶在浸润性宫颈癌及宫颈上皮内瘤变组织中的表达以及在宫颈癌发生、发展过程中的作用。方法30例浸润性宫颈癌(ICC组);90例宫颈上皮内瘤变(CIN),其中CINⅠ(CINⅠ组)30例,CINⅡ(CINⅡ组)30例,CINⅢ(CINⅢ组)30例。采用免疫组化Elivision二步法检测各组组织标本中HPV16-E7蛋白和端粒酶的表达。另设10例正常宫颈组织标本作为对照组。结果对照组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组和ICC组中的HPV16-E7蛋白阳性表达率分别为30.0%、63.3%、63.3%、76.7%和96.7%,ICC组和CINⅢ组显著高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05);而ICC组与CINⅢ组比较,CINⅢ组与CINⅡ组比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。对照组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组和ICC组的端粒酶阳性表达率分别为30.0%、40.0%、43.3%、70.0%和93.3%,ICC组显著高于CINⅢ组,CINⅢ显著高于CINⅡ组,差异均有统计学意义(均P<0.05);而CINⅡ组与CINⅠ组比较,CINⅠ组与对照组比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。浸润性宫颈癌及宫颈上皮内瘤变患者的HPV16-E7蛋白与端粒酶的表达呈正相关(r=0.376,P<0.01)。结论HPV16-E7蛋白和端粒酶的表达与宫颈癌的发生、发展有关。

HPV16型E6、E7变异与宫颈癌发生发展的研究进展

宫颈癌是全球15~44岁女性中第二常见的恶性肿瘤,每年的死亡人数约为265 653人,在中国,宫颈癌的发生率及死亡率仍较高。高危型人乳头状瘤病毒(HPV)持续感染是宫颈癌前病变及宫颈癌发生的必要条件,HPV16是最常见的高危人乳头瘤病毒。HPV16编码的E6和E7蛋白在HPV相关的肿瘤中起关键作用。近年来的研究揭示了HPV16 E6、E7基因的变异引起氨基酸变化可影响E6、E7蛋白与p53、pRb的结合,进而与宿主细胞恶性转化相关。本文将对近年来HPV16 E6、E7变异在宫颈癌发生发展中的作用作一综述。

新疆哈萨克族食管癌组织中HPV16E6、E7基因的检测与p53的关系

目的 探讨人乳头状瘤病毒(HPV)16型感染在新疆哈萨克族(哈族)食管癌发病中的作用,并分析HPV16感染与p53过表达之间的关系。方法 采用聚合酶链(PCR)技术.检测41例食管鳞状细胞癌组织中HPV16 E6与E7基因表达差异;用LSAB免疫组织化学方法分析p53蛋白的表达。结果 癌组织中HPV16 E6与E7基因阳性检出率分别为34.15％(14／41)和63.41％(26／41);用免疫组化检出p53蛋白阳性率分别在HPV16 E6阳性组(57.1％)与HPV16 E6阴性组(14.8％)间、HPV16 E7阳性组(42.3％)与HPV16 E7阴性组(6.7％)间均存在显著性差异(P<0.05);用PCR检出HPV16 E6、E7基因在食管癌的高分化组、中低分化组中的检出率分别为7.69％(1／13)、46.43％(13／28)和38.46％(5／13)、75.00％(21／28),差别均有统计学意义(P<0.05)。结论 提示p53基因突变与HPV16感染在哈族食管癌的发病过程中存在相互促进作用;另外,HPV16 E6与E7基因和哈萨克族食管癌病理组织学分级的生物学行为密切相关。

早期宫颈癌组织中ATG-12表达与HPV16-E6/E7-DNA病毒载量及预后的关系

目的探讨早期宫颈癌组织中自噬相关蛋白-12(ATG-12)与人乳头瘤病毒(HPV)16-E6/E7-DNA病毒载量及预后的关系。方法选取2015年1月至2017年12月期间在安徽皖北煤电集团总医院保存的宫颈活检或手术切除宫颈组织203例,包括30例慢性宫颈炎、18例宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ、23例CINⅡ、26例CINⅢ和106例早期(ⅠA2~ⅡB期)宫颈鳞状上皮癌(CSCC)。采用巢式多重聚合酶链式反应(NM-PCR)和免疫组化染色SP法检测组织中HPV 16-E6/E7-DNA病毒载量和ATG-12蛋白表达。分析ATG-12蛋白表达与早期CSCC临床病理特征的关系。随访CSCC患者无瘤生存时间(DFS)。采用Cox风险比例回归模型分析影响CSCC预后的因素。结果CSCC组织ATG-12蛋白阳性表达率为26.42%(28/106),低于慢性宫颈炎和CIN组织(P<0.05)。ATG-12蛋白表达与HPV16-E6/E7-DNA病毒载量呈负相关(r=-0.306,P=0.001;r=-0.436,P=0.001)。ATG-12蛋白表达与FIGO分期、间质浸润、淋巴脉管间隙浸润、淋巴结转移有关(P<0.05)。随访11~64个月,ATG-12蛋白阳性表达患者5年无瘤生存率为78.57%(22/28),ATG-12蛋白表达阴性患者5年无瘤生存率为60.26%(47/78)。多因素Cox风险回归模型结果显示,HPV16-E6/E7-DNA病毒载量和ATG-12蛋白表达是影响患者DFS的独立预后因素(P<0.05)。结论早期宫颈鳞状上皮癌组织中ATG-12阳性表达率低,与HPV16-E6/E7-DNA病毒载量呈负相关,有望成为评估HPV阳性早期宫颈癌患者预后的重要指标。

结直肠癌组织HPV16 E7 DNA及蛋白表达的研究

目的 分析不同部位、分期的结直肠癌及正常黏膜组织中人乳头状瘤病毒(human papilloma virus,HPV)16型E7的表达状况。方法 应用PCR及免疫组化方法检测82例手术切除的结直肠癌新鲜标本及距肿瘤近端10 cm以远的正常黏膜组织中HPV16 E7 DNA及蛋白的表达。结果 结直肠癌组织HPV16 E7 DNA表达阳性率为51.22%(42/82),明显高于正常黏膜组织的4.88%(4/82),P<0.01; 直肠癌组织中HPV16 E7 DNA表达阳性率为64.10%(25/39),明显高于升结肠癌的18. 18%(2/11), P<0. 05; HPV16 E7 DNA表达阳性率与Dukes分期有关(P<0.01),与癌组织分化程度无关。免疫组化染色显示,HPV16 E7蛋白主要为细胞核表达,胞浆也可见少量表达,进一步确认了HPV16的感染,且HPV16 E7蛋白与HPV16 E7 基因的表达具有相关性,免疫组化敏感性较PCR方法为低。结论 结直肠癌组织HPV16 E7 DNA及蛋白的表达阳性率明显高于正常黏膜组织,提示部分结直肠癌存在HPV16感染。癌灶部位距肛门越近,感染率越高; Dukes分期越晚感染率越高。

喉癌组织中HPV16及其早期区基因E6、E7蛋白的表达及意义

目的：观察喉癌组织中HPV16及其早期区基因E6、E7蛋白的表达，并初步分析其与喉癌组织临床分期、病理分级的相关性。方法：147例喉组织标本，其中喉鳞状细胞癌组织82倒，非癌组织39例（声带息肉27例，距肿瘤〉1．0cm的癌周正常组织12例），癌前病变（声带白斑）26例。免疫组织化学检测各组标本中HPV16及其早期区基因E6、E7蛋白的表达。分析喉鳞癌组织中3种蛋白表达情况与临床分期、病理分级的相关性。结果：喉鳞癌组织中HPV16蛋白及E6、E7蛋白的阳性率明显高于癌前病变组织（P〈0．05或0．01），后者高于非癌组织（P〈0．05或0．01）。非癌组织中HPV16蛋白阳性率明显高于E6、E7蛋白的表达（P〈0．05或0．01），而喉癌组织及癌前组织中三者间无显著差异。不同临床分期（Ⅰ～Ⅳ期）及不同病理分级（Ⅰ～Ⅲ级）喉癌组织中HPV16的阳性率间有显著差异（P〈0．05）；而不同临床分期及病理分级间HPv16 E6、E7蛋白表达率无显著差异。结论：HPV16感染后其早期区基因E6、E7的表达可能是诱发喉癌的因素之一，应用免疫学方法抑制E7蛋白的表达对于喉癌的治疗有积极的意义，但其预防和治疗作用不应过分夸大。

HPV16、HPV16 E7蛋白与Rb蛋白在喉癌发生中的作用

目的观察HPV16及其早期区基因E7表达蛋白与Rb蛋白在喉癌发生中的相关性,为探索喉癌的病因学提供依据。方法用免疫组织化学方法检测82例喉鳞癌、39例非癌组织标本中HPV16、HPV16 E7以及Rb的蛋白表达。结果HPV16 E7和Rb蛋白表达的阳性率在非癌及癌组织中有非常显著的差异(P<0.01),HPV16的阳性率在非癌及癌组织中有显著性差异(P<0.05)。喉癌组织中,Rb蛋白在HPV16和HPV16 E7阳性及阴性组中的阳性率显著不同(P<0.01),而在非癌组织中则无此现象(P>0.05)。结论喉癌组织中HPV16 E7的高表达导致的pRb功能失活是引起喉癌的主要原因之一。

16型人乳头瘤病毒E6、E7蛋白和端粒酶在宫颈上皮内瘤变发展中的表达及意义

目的研究16型人乳头瘤病毒(HPV16)E6、E7蛋白和端粒酶在宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌组织的表达,探讨其与宫颈癌前病变恶性进展间的关系,为寻找预测宫颈癌前病变转归方向的分子指标做一探索。方法采用免疫组织化学EnVision二步法检测30例原发性浸润性宫颈癌(ICC组,n=30)、CIN[CINⅠ-Ⅱ组,n=60;CINⅢ(含原位癌)组,n=30]、正常宫颈组织标本(正常组,n=10)中HPV16E6、E7蛋白和端粒酶的表达。结果 HPV16E6、E7蛋白和端粒酶在正常组、CINⅠ-Ⅱ组、CINⅢ组和ICC组中的阳性表达均呈逐级增高趋势。HPV16E6蛋白的表达:ICC组高于正常组,CINⅢ组高于正常组、CINⅠ-Ⅱ组,差异均有统计学意义(P<0.05);HPV16E7蛋白的表达:ICC组、CINⅢ组高于正常组,差异均有统计学意义(P<0.05);端粒酶的表达:ICC组高于CINⅢ组,CINⅢ组高于CINⅠ-Ⅱ组,差异均有统计学意义(P<0.05)。HPV16E6与HPV16E7蛋白、HPV16E6蛋白与端粒酶、HPV16E7蛋白与端粒酶的表达呈正相关(r=0.272,P<0.05;r=0.279,P<0.05;r=0.376,P<0.01)。结论 HPV16E6、E7蛋白和端粒酶随宫颈病变CIN的升级其阳性表达率、表达强度呈逐渐递增趋势。在宫颈癌变过程中HPV16E6、E7蛋白和端粒酶的阳性表达均呈正相关。HPV16E6、E7蛋白和端粒酶作为CIN的预后因子还尚待进一步研究。

改造的人乳头瘤病毒16型E6/E7融合蛋白疫苗抗肺癌作用的实验研究

目的 研究经改造的HPV16E6/E7蛋白质疫苗 (HPV 16mE6Δ/mE7)对表达HPV16E6和E7的小鼠肺癌细胞的体内生长抑制作用 ,为肺癌免疫治疗提供新线索。方法 预防性实验 :对C5 7BL/6小鼠先进行免疫 ,然后接种表达HPV 16E6和E7癌蛋白的TC 1肿瘤细胞 ;第 3 3天 ,对未出瘤小鼠进行第二次大剂量肿瘤细胞攻击。治疗性实验 :C5 7BL/6小鼠先接种TC 1细胞 ,然后进行两次免疫治疗 ,再对未出瘤小鼠进行第二次大剂量TC 1细胞攻击实验。计算各组肿瘤发生率、肿瘤体积。采用MTT方法检测淋巴细胞增殖反应。结果 预防性实验 :在 10 0天的观察时间内 ,免疫组小鼠可以有效抵抗第一、二次肿瘤细胞攻击 ,所有小鼠均未见肿瘤发生 ;而PBS组及单纯佐剂组小鼠在第一次肿瘤细胞接种后 6～ 12天内均有肿瘤形成 ,3 0天内因肿瘤负荷出现衰竭。在治疗性实验中 ,免疫组、PBS组、单纯佐剂组小鼠成瘤率分别为 2 0 %、90 %、60 % ;第二次攻击实验中 ,免疫组仍有 87.5 %的小鼠无肿瘤生长 ,而其他两组动物在 4～ 6天内均有肿瘤形成。MTT实验表明经mE6Δ/mE7免疫的小鼠脾淋巴细胞增殖反应明显强于对照组。结论 经改造的HPV16型mE6Δ/mE7蛋白质疫苗对于实验动物肺癌有较好的抑制作用 。

人乳头瘤病毒16型表位嵌合病毒样颗粒的构建及免疫原性研究

目的制备E749-57表位嵌合病毒样颗粒,并进行免疫原性分析。方法利用分子模拟软件Discovery Studio预测HPV16 L1的E749-57最佳嵌合位点,将E749-57表位嵌入预测位点。构建pET28a-16L1-E749-57重组质粒,于大肠杆菌中诱导表达HPV16L1-E749-57蛋白并利用镍柱进行亲和层析纯化。于体外重组VLPs后,进行动态光散射粒径和透射电镜分析。用E749-57嵌合VLPs免疫小鼠,假病毒中和试验检测免疫血清中和抗体滴度。流式多因子法检测Th1和Th2型细胞因子水平。结果HI loop区355/356为最佳表位嵌合位点。正确表达了HPV16 L1-E749-57蛋白并组装E749-57嵌合VLPs。E749-57嵌合VLPs免疫小鼠3次后,小鼠血清中和抗体滴度log10平均值达到4.23,略低于野生型VLPs(log10平均值为4.45)。但是,相对于野生型VLPs,E749-57嵌合VLPs诱导产生Th1型细胞因子(INF-γ,IL-2,TNF-α)的水平显著提高。结论本研究制备的E749-57嵌合VLPs能刺激机体同时产生较强的体液和细胞免疫应答,可能兼具预防和治疗双重功效,为宫颈癌治疗性疫苗的研制奠定基础。

宫颈癌与癌前病变中微小染色体维持蛋白7表达及与HPV16感染的关系

目的探讨宫颈病变组织中微小染色体维持蛋白7(MCM7)mRNA的表达及与HPV-16E7 mRNA的关系。方法采用半定量RT-PCR的方法检测2004年9月至2005年12月河北医科大学第二、第四医院102例宫颈组织中MCM7 mRNA和HPV-16E7 mRNA的表达。结果 (1)HPV-16E7 mRNA的表达水平在CINⅡ～Ⅲ及宫颈鳞癌明显高于慢性宫颈炎和CINⅠ(P<0.05);(2)MCM7 mRNA的表达水平在CINⅡ～Ⅲ及宫颈鳞癌明显高于慢性宫颈炎和CINⅠ,宫颈鳞癌明显高于CINⅡ～Ⅲ(P<0.05);(3)在CIN中,MCM7 mRNA在HPV16阳性组表达明显高于阴性组(P<0.01),在宫颈浸润癌中MCM7与HPV-16E7表达水平呈正相关(P<0.05);(4)在宫颈浸润癌中,MCM7 mRNA的表达随肿瘤分化程度增加而减少(P<0.05),而与年龄、临床分期无关。结论 HPV-16E7 mRNA的表达水平与宫颈病变的进展相关;MCM7 mRNA的表达与宫颈癌的发生、发展及与HPV-16感染密切相关。MCM7有望成为宫颈癌前病变筛查、监测生物学指标。

人乳头瘤病毒16型E7蛋白的原核表达与鉴定

本研究在大肠杆菌BL21中融合表达人乳头瘤病毒16型E7蛋白,并初步评价其应用价值。采用PCR技术扩增出HPV16E7基因,将其克隆进原核表达载体pGEX6p-1,转化至大肠杆菌BL21,利用IPTG进行诱导表达。以纯化的融合蛋白作为检测抗原建立间接ELISA方法,用于检测重组李斯特菌(Lm1-2-E7)免疫小鼠后的E7血清抗体水平。在25℃,0.5mM IPTG诱导下,HPV16E7蛋白在大肠杆菌BL21中获得表达,融合蛋白以可溶性形式存在,Western blot结果显示其与HPV16E7单克隆抗体发生特异性反应。二次免疫后小鼠血清经间接ELISA结果表明E7特异性抗体滴度为1∶200。结果表明GST-E7融合蛋白具有较强的免疫活性。