纳米雄黄混悬液诱导Siha细胞凋亡及对HPV16E6/E7表达的影响

目的：探讨纳米雄黄混悬液对人宫颈癌Siha细胞的抑制增殖、诱导凋亡作用及其对HPV16E6和E7致瘤基因的影响。方法：采用微射流法制备纳米雄黄混悬液,应用不同质量浓度（6.25,12.5,25,50 mg.L^-1）的纳米雄黄混悬液作用于Siha细胞不同时间（12,24,48,72 h）,光镜和透射电镜观察实验组（不同质量浓度的纳米雄黄混悬液处理组）和对照组（不加药物的细胞）细胞的形态学变化;琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞DNA Ladder形成;MTT比色法测定细胞生长抑制情况;流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期改变;RT-PCR方法检测HPV16E6和E7的表达。结果：纳米雄黄混悬液25~50 mg.L-1处理Siha细胞48,72 h后,细胞存活率降低,凋亡增加,作用呈时间-剂量依赖关系。电镜显示细胞呈典型的凋亡形态学改变,琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞DNA Ladder形成;流式细胞术检测证实细胞凋亡率与纳米雄黄混悬液作用浓度呈明显相关,与对照组相比,差异有极显著意义（P〈0.01）,且细胞呈G0-G1期阻滞。RT-PCR检测显示随着纳米雄黄混悬液作用浓度的增加,HPV16E6和E7的表达不同程度地受到抑制。结论：纳米雄黄混悬液对于Siha细胞具有诱导凋亡、抑制增殖的作用,其机制可能与其抑制HPV16E6和E7致瘤基因的表达有关。

siRNA抑制HPV16E6基因对鼻咽癌细胞生物学特性的影响

目的通过RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术干扰E6癌基因的表达,探讨小干扰RNA(small interferirngRNA,siRNA)对鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)HNE-1细胞生物学特性的影响。方法针对人乳头瘤病毒(humanpapilloma vinus,HPV)16 E6基因设计合成4条siRNA,利用lipofectamineTM2000脂质体转染鼻咽癌HNE-1细胞。通过半定量逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)及Western blot检测转染后细胞E6 mRNA和蛋白变化,采用MTT检测转染后癌细胞的生长增殖情况,流式细胞仪PI染色法检测细胞的凋亡率。结果转染有效siRNA后,PT-PCR及Western blot结果显示,HNE-1细胞E6基因mRNA和蛋白的表达明显降低,抑制率分别为66.3%、56.7%。MTT法检测显示,细胞的生长增殖受到明显抑制。流式细胞仪检测细胞凋亡,发现凋亡率增加。结论siRNA可以有效干扰鼻咽癌HNE-1细胞内HPV16E6基因的表达,从而诱导肿瘤细胞的凋亡。

HPV16E6与抑癌基因p53在口腔癌中的表达及临床意义

目的 :探讨HPV16E6基因和p53基因在口腔癌中的表达,以及口腔癌的病理分级和临床分期与HPV16E6基因及p53基因的相关性。方法:纳入173例口腔癌、98例口腔癌癌前病变以及79例癌周正常组织,采用免疫组织化学方法进行HPV16E6和p53表达水平检测,统计口腔癌、口腔癌癌前病变、癌周正常组织以及不同病理分级和临床分期的口腔癌中HPV16E6基因及p53基因的阳性表达情况,采用SPSS21.0软件包对数据进行χ2检验。结果:在口腔癌组织中,HPV16E6的阳性表达率为81.5%(141/173),p53的阳性表达率23.7%(41/173);在口腔癌癌前病变组织中,HPV16E6的阳性表达率为39.8%(39/98),p53的阳性表达率为57.1%(56/98);在口腔癌癌周正常组织中,HPV16E6的阳性表达率为2.5%(2/79),p53的阳性表达率为89.9%(71/79)。3组中HPV16E6的阳性表达率和p53的阳性率表达存在差异,其中,HPV16E6在口腔癌中的阳性表达率显著高于其他2组(P<0.05);而口腔癌中p53的阳性表达率显著低于其他2组。随着口腔癌患者临床分期和病理分级的增加,HPV16E6阳性表达率逐渐升高,而p53的阳性表达率则显著下降(P<0.05)。结论:HPV16E6蛋白和p53蛋白在口腔癌的发生与发展过程中可能发挥十分重要的作用。

利用昆虫-杆状病毒表达系统制备HPV16E6蛋白

目的利用昆虫-杆状病毒表达系统高效表达HPV16E6蛋白。方法将HPV16E6基因克隆入供体质粒pFastBac-HTb,然后再重组入杆状病毒基因组;用带有目的基因的杆状病毒转染昆虫(Sf-9)细胞,27℃培养72 h,收集被转染细胞,SDS-PAGE,Western-blot分析鉴定表达蛋白。结果SDS-PAGE分析显示所表达蛋白分子量约为24KD,Western-blot结果表明表达产物为HPV16E6蛋白。结论利用昆虫杆状病毒表达系统获得HPV16E6蛋白的高效表达。

宫颈癌患者治疗前检测血清HPV16E6 mRNA和CK19 mRNA的临床意义

目的检测宫颈癌患者治疗前外周血HPV16E6m RNA和CK19m RNA的表达,探讨其对宫颈癌的诊断意义及其与临床病理的相关性.方法对100例宫颈癌患者行治疗前外周血HPV16E6m RNA及CK19m RNA检测,以40例健康妇女为对照,分析其作为诊断参考的特异性和敏感性,并对两者与宫颈癌临床病理特征的相关性进行分析.结果 HPV16E6m RNA、CK19m RNA检测诊断宫颈癌的特异性均为97.5%.HPV16E6m RNA、CK19m RNA升高用于治疗前诊断的敏感性分别为15%和39%,两者差异有统计学意义(P<0.05).HPV16E6m RNA升高与临床分期(P=0.012)、盆腔淋巴结转移(P=0.026)相关.CK19m RNA升高与深肌层浸润(P=0.031)、盆腔淋巴结转移(P=0.027)相关.结论外周血HPV16E6m RNA和CK19m RNA均是宫颈癌微转移有价值的肿瘤标志物;CK19m RNA在作为宫颈癌指标时,临床诊断价值优于HPV16E6m RNA.

中国妇女宫颈癌中HPV16E6基因序列分析及分子克隆

人乳头瘤病毒16型（Humanpapillomavirustype16，HPV16）感染与宫颈癌的发生有密切关系。研究发现，HPVI6早期蛋白E6是肿瘤相关抗原，可在HI，V相关肿瘤中持续表达，为肿瘤治疗性疫苗的研制及免疫治疗提供了靶位。但也有文献报道，宫颈癌中HPVI6E6基因可有一定的变异性，...

表达HPV16E6和E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒的构建

为研制HPV16的治疗性疫苗 ,首先将表达质粒 pJSA1175与非复制型痘苗病毒NTVJTK+ 进行同源重组 ,构建了痘苗重组病毒NTVJLac。再将表达质粒 pJSDME6E7R与NTVJLac进行同源重组 ,构建了表达HPV16E6和E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒NTVJmE6E7,并对获得的重组病毒进行了鉴定。Southern杂交显示 ,重组痘苗病毒NTVJmE6E7基因组中有E6和E7基因插入。该重组病毒在人源细胞中不复制。Westernblot显示 ,重组病毒在人源TK-14 3细胞中能表达E6和E7蛋白。

抗HPV16E6全蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备特异性识别HPV16E6蛋白的单克隆抗体,为建立HPV早期诊断试剂盒提供有效试剂,通过细胞融合、间接ELISA方法筛选阳性克隆、多次亚克隆得到稳定分泌抗体的单克隆杂交瘤细胞株,体内诱生法大量制备腹水,过UNOsphere SuPrA^(TM)柱和ENrich^(TM)SEC650分子筛柱纯化,通过蛋白电泳鉴定其纯度并测定抗体浓度,并采用Western Blot法和间接免疫荧光法验证纯化后HPV16E6抗体与HPV16型阳性Caski细胞和HPV18型阳性Hela细胞特异性结合。建立了亚型为IgG2a的单克隆HPV16E6-4D4杂交瘤细胞株,两步纯化后得到纯度较高的抗体,可特异性识别HPV16型阳性的Caski细胞中的E6蛋白,不与Hela细胞反应,为在蛋白水平上检测HPV16型病毒提供了新手段。

新疆妇女宫颈脱落细胞HPV16E6基因的PCR及荧光定量PCR检测

目的 了解新疆妇女人乳头瘤病毒 16型 (HPV 16)的感染状况。方法 用PCR及荧光定量PCR(FQ -PCR)方法检测妇科门诊普通患者宫颈脱落细胞及分泌物中人乳头瘤病毒 16型E6基因 (HPV16E6) ,以普通门诊患者宫颈脱落细胞及分泌物DNA作为样本 ,以人乳头瘤病毒 (HPV16E6)作为扩增的靶基因 ,同时以人 β -actin基因片段作为细胞内参照 ,借助于两对引物 ,两个特异的荧光探针 ,用荧光定量PCR(FQ -PCR)方法对这两个片段进行扩增 ,得到单位细胞HPV16E6的相对含量 ;同时进行定性PCR检测。结果 宫颈脱落细胞标本 15 9例中 ,β -actin阳性 15 4例 ;HPV 16E6阳性共 12例 ,阳性率为 7.8%。PCR与FQ -PCR结果基本一致 ,但FQ -PCR更敏感。结论 建立的FQ -PCR检测宫颈脱落细胞内HPV 16E6基因的方法 ,能反映单位细胞内病毒的复制情况 ,可用于性传播感染 (STI)

负载HPV16E6基因树突状细胞疫苗的构建

目的以阳离子脂质体为载体,构建载入人乳头瘤病毒16型E6蛋白(HPV16E6)基因树突状细胞(DC)疫苗,研究其安全性及转染效率。方法将pcDNA3.1-HPV16E6质粒与阳离子脂质体混合形成复合物后转染树突状细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪及免疫细胞化学检测基因表达效率。结果转染后的DC可见胞浆内颗粒增多,胞质突起增加,细胞生长良好。免疫细胞化学、流式细胞仪结果DC转染率49.8%。结论阳离子脂质体可用于DC疫苗构建,具有高效性及安全性。

HPV16E6蛋白及抑癌基因p53在口腔癌中的表达研究

目的研究HPV16E6蛋白及抑癌基因p53在口腔癌中的表达。方法回顾性分析100例口腔癌患者的临床资料和病理切片,采用免疫组织化学方法检测口腔癌组织中p53和HPV16E6蛋白的阳性表达情况,分析其与患者临床分期和病理分级的关系。结果男性口腔癌患者的p53阳性表达率低于女性患者,HPV16E6阳性表达率高于女性患者;年龄>50岁口腔癌患者的p53阳性表达率高于年龄≤50岁的患者,HPV16E6阳性表达率低于年龄≤50岁的患者,但差异均无统计学意义(P>0.05)。口腔癌患者的组织切片显示,p53阳性表达细胞较少,而HPV16E6阳性表达细胞较多。随着患者临床分期的升高(Ⅰ~Ⅳ期),p53阳性表达率呈下降趋势,HPV16E6阳性表达率呈上升趋势,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者与Ⅰ期患者的p53和HPV16E6阳性表达率比较,差异均有统计学意义(P<0.05);随着患者病理分级的升高(Ⅰ~Ⅲ级),p53阳性表达率呈下降趋势,HPV16E6阳性表达率呈上升趋势,Ⅱ、Ⅲ级患者与Ⅰ级患者的p53和HPV16E6阳性表达率比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论口腔癌患者的p53阳性表达率随患者病理分级与临床分期的升高而降低,HPV16E6阳性表达率随患者病理分级与临床分期的升高而升高,p53阳性表达率的降低和HPV16E6阳性表达率的升高可能与口腔癌的发生和发展有关。

宫颈不同级别病变组织中HPV16E6及hWAPL基因表达情况及两者的关系

目的探讨宫颈不同级别病变组织中人乳头状瘤病毒(HPV)16E6及hWAPL基因表达情况及两者的关系。方法选取宫颈不同级别病变患者120例,收集其病变组织宫颈液基细胞学样本及临床病理资料,应用液基细胞学技术和免疫细胞化学技术,研究hWAPL蛋白在正常宫颈、癌前病变及宫颈癌的液基细胞中的表达;检测宫颈HPV-DNA,研究正常宫颈、癌前病变及宫颈癌中HPV感染情况;比较hWAPL表达及HPV感染在正常宫颈、癌前病变及宫颈癌液基细胞中的分布特征,并进行统计学分析;在上述实验的基础上,进一步构建以宫颈液基细胞为检测对象的宫颈癌筛选模式。结果 HPV16E6及hWAPL在宫颈癌组的阳性表达率大于正常宫颈组、癌前病变组(P <0.05);HPV16E6及hWAPL的表达强度大于正常宫颈组、癌前病变组(P <0.05);HPV16E6及hWAPL蛋白在不同宫颈不同级别病变组织中表达具有相关性(P <0.05)。结论 hWAPL表达对宫颈上皮内瘤变的诊断有参考价值,hWAPL表达强度对进一步明确ASCUS中的组织学类型具有参考价值,值得临床推广与应用。

HPV16E6与吲哚胺2,3-二氧化酶在宫颈病变组织中的表达

目的检测高危HPV感染的正常宫颈组织、宫颈癌前病变组织、宫颈癌组织HPV16E6和IDO的表达,分析二者在宫颈病变组织恶化过程中的关系,探讨其作为宫颈癌肿瘤标志物的可能性。方法把经第二代杂交捕获(HC-2)法行HPV DNA检测为高危型HPV感染的宫颈病变者120例为实验对象,正常宫颈组织、宫颈癌前病变组织、宫颈癌组织各40例。免疫组化染色法检测各组织中HPV16E6和IDO的表达情况。结果 40例正常宫颈组织中HPV16E6和IDO阳性表达率分别为7.5%、0%;40例宫颈癌前病变组织中HPV16E6和IDO阳性表达率分别为37.5%、22.5%。40例宫颈癌组织中HPV16E6和IDO阳性表达率分别为90%、 80%。在宫颈病变组织恶化过程中HPV16E6和IDO的阳性表达呈正相关(rs=0.710, P=0.000)。结论 HPV16E6和IDO的表达随宫颈病变的进展而呈现出阳性程度逐渐递增趋势,HPV16E6和IDO可考虑成为预测宫颈病变组织恶化的肿瘤标志物。

HPV16E6和p53在口腔癌中的表达及相关性研究

目的探讨HPV16E6和抑癌基因p53在口腔癌中的表达,及其与口腔癌临床分期、病理分级的相关性。方法用免疫组织化学方法检测149例口腔癌、88例口腔癌癌前病变和49例癌周正常组织标本中HPV16E6和p53的表达,统计口腔癌不同临床分期和病理分级中HPV16E6和p53的阳性表达率。结果口腔癌组织、口腔癌癌前病变组织和口腔癌癌周正常组织中HPV16E6的阳性表达率分别为79.9%(119/149)、38.6%(34/88)和2.0%(1/49),p53的阳性表达率分别为24.2%(36/149)、55.7%(49/88)和91.8%(45/49)。随着临床分期和病理分级的增加,HPV16E6阳性表达率明显增加,而p53阳性表达率却明显减少(P<0.05)。结论 HPV16E6蛋白的表达升高和p53蛋白的表达降低可能会导致口腔癌的发生和发展。检测患者口腔癌组织中HPV16E6和p53的表达可用于评定口腔癌的恶性程度。

新疆汉族乳腺癌及乳腺良性病变组织中HPV16E6的半巢式PCR检测

了解新疆地区汉族乳腺癌及乳腺良性病变组织中人类乳头状瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染的情况,探讨乳腺癌及乳腺良性病变是否存在HPV16感染及HPV16感染与乳腺癌发病之间的关系。采用半巢式PCR(semi-nested polymerase chain reaction)技术检测80例乳腺癌及60例乳腺良性病变组织中HPV16感染的情况。结果80例乳腺癌病例中,有22例(27.5%)检测到HPV16的DNA片断;60例乳腺良性病变中,有2例(3.3%)检测到HPV16的DNA序列,检测结果作χ2检验,χ2=14.10,P<0.001,差异有统计学意义。新疆汉族乳腺癌及乳腺良性病变存在HPV16感染,HPV16在乳腺癌的发病中发挥着一定的作用。

抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞侵袭表型和VEGF表达的影响

目的探讨特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞侵袭表型和VEGF表达的影响。方法以脂质体法将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,分别为CaSKi-R和CaSKi-P。测定CaSKi,CaSKi-R和CaSKi-P 3种细胞的生长曲线、软琼脂克隆形成率和裸鼠体内成瘤性,RT-PCR检测3种细胞中VEGF的表达。结果CaSKi、CaSKi-P细胞生长速率和软琼脂克隆形成率相近,CaSKi-R细胞的生长速度和软琼脂克隆形成率明显降低。CaSKi 、CaSKi-P致瘤性无显著差异,而CaSKi-R致瘤性显著低于CaSKi(P<0.05)。RT-PCR检测CaSKi-R细胞的VEGF mRNA的表达水平明显低于CaSKi、CaSKi-P细胞的表达,而后者的VEGF mRNA的表达水平相近。结论特异性抗HPV16E6核酶的导入降低了宫颈癌CaSKi细胞的增殖和侵袭表型,可能与宫颈癌CaSKi细胞内VEGF的表达下降有关。

HPV16E6 siRNA联合5-Aza-CdR对宫颈癌SiHa细胞中E-钙黏蛋白表达和基因甲基化的影响

目的:探讨HPV16E6 siRNA联合5-Aza-CdR(5-aza-2'-deoxycytidine,5-氮-2'-脱氧胞苷,又称地西他滨)对宫颈癌SiHa细胞中E-钙黏蛋白表达和基因甲基化的影响。方法:采用SiHa细胞构建的HPV16E6 沉默细胞株及5-Aza-CdR细胞株,检测细胞中E-cadherin mRNA和蛋白表达,以及E-cadherin甲基化状态。采用细胞黏附、Transwell体外侵袭、迁移实验检测5-Aza-CdR和siRNA E6对SiHa细胞黏附、侵袭迁移的影响。结果: 5-Aza-CdR+siRNA E6组较5-Aza-CdR组、siRNA E6组中E-cadherin mRNA 及蛋白表达均上升,细胞的黏附率、侵袭抑制率和迁移抑制率均升高;5-Aza-CdR+siRNA E6组较5-Aza-CdR组、siRNA E6组中E-cadherin基因启动子区甲基化指数明显下降。结论: HPV16E6 siRNA联合5-Aza-CdR可显著引起宫颈癌细胞中E-cadherin 基因低甲基化,并可导致E-cadherin mRNA 及蛋白的表达水平明显上调,肿瘤细胞黏附能力升高,侵袭迁移能力下降,两者在一定程度起到协同作用。

新疆南部维吾尔族妇女HPV16E6,E7基因突变与宫颈癌及癌前病变的相关性研究

目的:本研究检测HPV16E6,E7基因突变在新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌及癌前病变组织中的发生情况,探讨HPV16E6,E7基因突变与宫颈病变及宫颈癌的关系。方法:以德国标准株HPV16 DNA为原型对新疆南部维吾尔族妇女宫颈癌40例及癌前病变80例组织提取HPV16DNA,对其E6E7PCR扩增产物进行测序后进行对比,分析其突变情况。结果:HPV16阳性率分布:宫颈癌85%(34/40),CINⅡ～Ⅲ42.5%(17/40),CINI 10%(4/40),对照组0(0/40)。HPV16E6突变率:宫颈癌中突变40%(16/40),CINⅡ-Ⅲ中突变15%(6/40)。(x^2=0.023,P= 0.011,r=0.998,P=0.038),HPVE7突变率:宫颈癌中突变7.5%(3/40),CINⅡ～Ⅲ组中突变率7.5%(3/40).CINI中突变率0(x^2=0.413,P=0.520),E6E7同时突变率:宫颈癌组中突变率15% (6/40);CINⅡ～Ⅲ中突变率7.5%(3/40),CINI中0(0/40),(x^2=6.342,P=0.01 1)。结论:1. HPV16在宫颈癌,癌前病变的突变以单一的E6突变和E6,E7同时突变为主。2.随着宫颈病变向宫颈癌发展其发生突变率也随之增加。

HPV16E6真核表达载体的构建及其在CaSki细胞中的表达及定位

目的:构建pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体,转染CaSki细胞,检测其在CaSki细胞中的表达。方法:用RT-PCR法从CaSki细胞中扩增出带有HindⅢ、XbaⅠ酶切位点的HPV16E6基因片段,将HPV16E6基因全长片段克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因真核表达载体pEGFP-C2上,通过脂质体将pEGFP-C2-HPV16E6转染入CaSki细胞。结果:pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体构建成功,转染CaSki细胞48h后经RT-PCR及Western-blot检测可见HPV16E6蛋白的高表达,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白主要在CaSki细胞核内表达。结论:成功构建了pEGFP-C2-HPV16E6真核表达载体,为进一步对HPV16E6的研究奠定了基础。

朗格汉斯细胞与宫颈癌及HPV16E6的关系

目的:研究宫颈组织中朗格汉斯细胞(LC)的数量、形态及分布特点与宫颈癌及人乳头瘤病毒(HPV)16E6的关系。方法:用免疫组织化学技术(SP染色法)对标本的朗格汉斯细胞进行检测,以直接PCR法检测HPV16E6并对E6基因测序。结果:40例宫颈鳞癌,16例宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅱ/Ⅲ级与14例正常宫颈组织中,S-100蛋白阳性LC数量在正常组、CINⅡ/Ⅲ组、宫颈癌组中依次增加(P=0.000),与宫颈癌的临床分期呈负相关(R=-0.552,P=0.000),随宫颈癌组织分化程度降低而减少(P=0.039),与淋巴结转移无关(P=0.245)。HPV16E6在正常对照组、CINⅡ/Ⅲ组和浸润癌组中的阳性率依次上调(P=0.000)。HPV16E6(+)组中LC数量比HPV16E6(-)组少(P=0.011)。LC的表达在HPV16E6原型组和在HPV16E6D25E突变株组中无统计学差异(P=0.813)。结论:LC功能缺陷与宫颈癌的发生有关。