宫颈腺癌细胞中HPV18-E7与上皮间质转化的关系研究

目的:探究宫颈腺癌细胞中HPV18-E7与上皮间质化(EMT)之间的关系。方法:针对HPV18-E7的si RNA转染入人宫颈腺癌He La细胞,观察细胞形态变化,并运用Real-time PCR技术、免疫印迹实验和细胞免疫荧光染色实验在m RNA水平和蛋白水平检测E7、EMT相关的标记因子的表达及定位变化;应用细胞划痕愈合实验及Transwell细胞体外侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果:特异性沉默HPV18-E7表达后He La-SIE7细胞间连接变得疏松,细胞中E7与间质性标记物的m RNA及蛋白表达水平较对照组细胞显著下降,上皮性标记因子较对照组细胞明显增加(P<0.01);随着He La细胞E7表达的下调,Ecadherin在细胞膜上的表达增加,间质性标记因子在细胞质内的表达随之下降。He La-SIE7细胞迁移及侵袭能力明显低于对照组(P<0.01);沉默HPV18-E7表达的He La细胞其增殖能力也明显减弱。结论:宫颈腺癌细胞中HPV18-E7能够引起EMT,促进肿瘤发生侵袭转移。

HPV18-E7介导的上皮间质转化与抑癌基因Rb的关系研究

目的探究宫颈腺癌细胞中HPV18-E7介导的上皮间质化(EMT)与抑癌基因Rb之间的关系。方法针对HPV18-E7的siR N A转染入人宫颈腺癌HeL a细胞运用R ealtime PCR技术、免疫印迹实验在mRNA水平和蛋白水平检测E7与Rb的表达变化;Real-time PCR技术筛选特异性针对Rb基因的siR NA,并将其转染入HeL a-siE 7细胞运用免疫印记实验检测EMT相关的标记因子的表达变化,CCK-8细胞增殖实验和免疫荧光染色法检测细胞增殖能力及细胞骨架的变化;最后用染色质免疫沉淀和real-time PCR技术检测Rb是否通过作用于E-cadherin基因的启动子区来发挥调控其表达的作用。结果HeL a-siE 7细胞内R b表达较对照组细胞显著上调;HeL a-siE 7-siR b细胞较HeL a-siE 7细胞E-cadherin的表达明显下调,vimentin的表达却显著上调;HeL a-siE 7-siR b细胞增殖能力显著增强;沉默E7表达后细胞失去极性,呈卵圆形,而在沉默E7表达的基础上沉默Rb后,细胞又重新获取细胞极性变回梭形;染色质免疫沉淀实验结果表明抑癌基因Rb可直接作用于上皮性标记因子E-cadherin的启动子区。结论 HPV18-E7能够结合抑癌基因Rb使其失去活性从而致使其无法绑定在上皮标记因子E-cadherin启动子区来调控其表达,最终导致宫颈腺癌发生EMT,促进肿瘤发生侵袭转移。

HPV18 E7基因的原核表达及其在宫颈癌患者血清抗体中的检测

目的研究人类乳头瘤病毒18型E7全长基因(HPV18 E7)在原核表达系统中的表达,及其作为特异性抗原在宫颈癌血清抗体检测中的意义,为HPV感染与肿瘤相关的血清学诊断研究奠定基础。方法PCR法扩增HPV18 E7全长基因,构建重组质粒pET32a(+)/HPV18 E7,转化表达HPV18 E7融合蛋白后经纯化、SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。再以该融合蛋白作为诊断抗原,间接ELISA法检测宫颈癌、尖锐湿疣及健康对照三组血清特异性IgG抗体水平。结果HPV18 E7融合蛋白表达量约占菌体总蛋白的35.00%;宫颈癌、尖锐湿疣及健康对照组的血清特异性抗体均值分别为0.604±0.328,0.287±0.202和0.342±0.225,三组间差异有显著性意义(F=32.771,P<0.01);宫颈癌组与尖锐湿疣组及健康对照组的HPV18E7均值比较,差异均有显著性意义(P均<0.01),而尖锐湿疣组与健康对照组抗体均值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论HPV18 E7融合蛋白具较强的抗原性,对宫颈癌诊断试剂的研究具有应用价值。

抑制HPV18型E7蛋白的表达对Hela细胞生物学特性及miR-204表达的影响

目的通过小干扰RNA(siRNA)抑制宫颈癌Hela细胞中人乳头瘤病毒(HPV)18型E7的表达,研究E7蛋白对Hela细胞的生物学特性和miR-204表达的影响和关系,探索HPV致癌的分子机制。方法设计合成靶向HPV18型E7基因的siRNA,转染Hela细胞,抑制HPV18-E7的表达;采用RT-PCR和Western blot分别检测Hela细胞中HPV18-E7的mRNA和蛋白水平,用流式细胞术检测Hela细胞的细胞周期和凋亡,通过荧光实时定量PCR检测miR-204的表达水平。结果 pRNAT-HPVE7与两个对照组比较,明显抑制了Hela细胞HPV18-E7的mRNA(t值分别为2.69、2.46,均P<0.05)和蛋白(t值分别为3.93、4.20,均P<0.05)的表达,细胞周期趋于正常,凋亡率增高(t值分别为-6.87、-6.92,均P<0.05),miR-204表达水平也明显升高(t值分别为0.26、0.22,均P<0.05)。结论抑制HPV18-E7基因的表达能改变Hela细胞的生物学特性和上调miR-204表达。

siRNA沉默HPV18-E7基因表达对人宫颈癌HeLa细胞凋亡和增殖的影响

研究小干扰RNA(siRNA)沉默18型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus 18,HPV18)E7基因对人宫颈癌HeLa细胞凋亡和增殖的影响。培养人宫颈癌HeLa细胞株,构建靶向E7基因的两条siRNA,转染HeLa细胞株(实验组:分为siE7-1组和siE7-2组),以不做任何处理的HeLa细胞作为空白对照组(NC),转染无功能siRNA的HeLa细胞作为阴性对照组(Scramble,SCR)。转染48h后,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测转染E7siRNA后HeLa细胞mRNA含量变化;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测E7蛋白表达量变化;流式细胞术Flow cytometry(FCM)检测HeLa细胞凋亡情况;克隆形成和CCK-8检测HeLa细胞生长增殖情况。与NC组相比,siE7-1组和siE7-2组E7基因mRNA表达明显下调,差异有统计学意义(P<0.01);转染48h后,与NC组相比,siE7-1和siE7-2实验组HeLa细胞内HPV18-E7蛋白表达水平明显下降(P<0.05);转染48h后,siE7-1组和siE7-2组的细胞凋亡率分别为17.78%和36.44%,与NC组相比明显增多,差异有统计学意义(P<0.01),细胞凋亡结果提示siRNA沉默E7促进HeLa细胞凋亡;CCK-8实验结果显示siE7-1组和siE7-2组细胞生长增殖抑制,差异有统计学意义(P<0.01);克隆形成实验结果与CCK-8实验结果一致,siE7-1组和siE7-2组HeLa细胞形成的克隆数明显少于NC组,细胞生长增殖抑制(P<0.01)。研究结果表明,沉默E7基因促进人宫颈癌HeLa细胞凋亡,抑制增殖,为宫颈癌治疗提供潜在靶点。