HPV58 E6的基因克隆及HLA-DQB1*03限制性T细胞表位分析

目的:克隆HPV58E6的基因,并对其HLA-DQB1*03限制性T细胞表位进行分析。方法:从宫颈癌组织中提取基因组DNA,通过PCR方法扩增HPV58E6基因,常规方法将目的基因插入pGEM-TEasy载体中。酶切和测序鉴定后,利用位置特异性分数矩阵(PSSM)理论、支持向量机(SVM)理论和蛋白酶体酶切位点预测算法分析HPV58E6的HLA-DQB1*03限制性T细胞表位。结果:成功克隆了1株HPV58E6基因(GenBank EF060239),表位47FADLRIAY-RDGNPFA和表位102RCIICQRPLCPQEKK理论上是其HLA-DQB1*03限制性T细胞表位。结论:这两个表位可望作为后续相关实验中表位筛选、鉴定和多肽疫苗研制的候选对象。

HPV52和HPV58感染与患者发生宫颈上皮病变风险的相关性分析

目的分析HPV52和HPV58感染与患者发生宫颈上皮病变风险的相关性。方法选取2018年10月至2021年10月进行检查的816例人乳头瘤病毒(HPV)感染者,患者分别接受宫颈液基薄层细胞学(TCT)检查、HPV基因分型检测、阴道微生态检查。将感染高危型HPV且TCT结果为宫颈上皮病变的294例患者分为低级别鳞状上皮病变组(LSIL)138例、高级别鳞状上皮病变组(HSIL)127例、宫颈癌组29例。分析不同宫颈上皮病变程度患者感染高危型HPV的型别分布情况,评估HPV52和HPV58感染、阴道微生态异常与宫颈上皮病变程度的相关性。结果816例HPV感染者中检出高危型HPV感染者294例,其中感染率较高的型别是HPV16、52、58,感染率分别为36.73%、15.99%、13.95%。LSIL组、HSIL组、宫颈癌组患者的HPV52和HPV58感染率以及pH值、白细胞酯酶、唾液酸苷酶、过氧化氢(H_(2)O_(2))阳性率随着宫颈上皮病变程度加重而依次递升(P<0.05)。结论HPV16、52、58属于高危型HPV感染型别,其中HPV52和HPV58感染、阴道微生态异常与宫颈上皮病变程度呈正相关,感染率和阳性率随着宫颈上皮病变程度加重而升高。

预防性重组HPV58-减毒志贺氏杆菌载体活疫苗的研制及免疫学特性

目的:构建预防性重组HPV58-减毒志贺氏杆菌载体活疫苗,并研究其免疫学特性。方法:克隆HPV58L1基因并重组入自杀载体pCVD442,减毒志贺氏杆菌Sf301:ΔvirG、辅助质粒PRK2013、重组自杀载体pCVD442-HPV58L1进行筛选杂交,经氨苄抗性培养基、刚果红培养基双重选择,获得重组的含HPV58L1基因的减毒志贺氏杆菌菌株。Western blot检测HPV58L1蛋白表达。用豚鼠角结膜炎模型进行疫苗动物免疫试验,ELISA检测豚鼠血清中特异性抗体,ELISPOT检测豚鼠脾及淋巴结中抗原特异性IgG、IgA产生细胞频数。结果:Western blot法证实该菌株可表达HPV58L1蛋白。豚鼠免疫保护试验发现:HPV58L1-减毒志贺氏杆菌不引起角结膜炎,经用野生型sf301攻击后有80%豚鼠不发病。免疫后第20天,免疫豚鼠血中抗HPV58L1特异性IgG、IgA明显升高,而对志贺氏杆菌菌体抗原(LPS)仅产生低效价的IgG抗体。ELISPOT结果显示,脾和淋巴结的IgA-ASC及IgG-ASC明显升高。结论:成功构建了预防性重组HPV58-减毒志贺氏杆菌载体活疫苗,能诱发免疫动物较强的体液免疫反应,激发保护性抗体的产生。

HPV58/52感染与宫内病变发生风险的相关性分析

目的了解石家庄市女性患者高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染状况,探讨HPV58/52感染与宫内病变发生的相关性。方法采用核酸分子导流杂交技术(PCR),对参与石家庄市宫颈筛查的2 234例女性患者进行HPV分型检测,同时行液基细胞学检查(TCT)。其中HR-HPV感染者812例,根据TCT结果将其分为宫颈炎症组175例、低度鳞状上皮内瘤病变(LISL)组312例、高度鳞状上皮内瘤病变(HSIL)组286例及鳞状细胞癌(SCC)组39例。其中HPV58/52感染者240例,分析HPV58/52感染与宫颈病变发生风险的相关性。结果 812例HR-HPV感染者中感染率较高的是HPV16(30.7%)、HPV52(15.6%)、58(13.9%),明显高于其他HR-HPV基因型(P<0.05);与不同宫内病变程度HPV58/52感染差异有统计学意义(P<0.05)。结论石家庄市女性患者中感染HPV主要基因型为HPV16、52、58;除公认的HPV16与宫颈癌发生密切相关外,HPV58/52亦存在较强的致病性,为今后宫内病变的防治提供重要依据。

HPV58型衣壳蛋白L1和L2基因的克隆表达及病毒样颗粒的装配

目的大量表达和纯化HPV58衣壳蛋白,形成病毒相似颗粒。方法制备携带HPV58L1和L2基因的重组杆状病毒,转染昆虫细胞,在真核细胞中大量表达HPV58L1和L2蛋白并进行纯化。电镜观察病毒相似颗粒的形成情况。免疫小鼠制备特异性抗血清。结果 HPV58L1和L2蛋白在真核细胞中被高效表达,电镜下见表达纯化的病毒衣壳蛋白L1与L2共同组装形成病毒相似颗粒(VLPs),用其免疫小鼠能产生针对HPV58L1蛋白的高滴度的特异性抗体。结论在真核细胞中大量表达HPV58L1和L2蛋白,纯化后能形成病毒相似颗粒,并具备很强的免疫原性,有望用其制作宫颈癌预防性疫苗。

利用基因工程技术制备HPV58E7蛋白

目的利用基因工程技术制备HPV58E7蛋白。方法设计E7基因片段特异性PCR引物,以HPV58全基因组为模板,经PCR扩增E7基因片段,利用pGEX-4T3表达质粒,构建pGEX-4T3/HPV58E7重组体,转化BL21宿主细胞,IPTG诱导表达带有GST标签的可溶性融合蛋白。经谷胱甘肽凝胶柱亲和层析纯化,凝血酶切GST标签。结果 SDS-PAGE分析显示在分子量约为40KD处有新生蛋白条带,经凝血酶消化融合蛋白,所获纯化HPV58E7蛋白与预期理论值相吻合。结论利用带有GST标签的原核表达系统及其相应纯化策略,获得HPV58E7蛋白的高效制备。

采用反向PCR技术优化适合毕赤酵母表达的截短型HPV58型L1基因

目的:探讨利用反向聚合酶链反应(反向PCR)技术根据毕赤酵母偏爱密码子优化截短型人乳头瘤病毒58型(HPV58)L1基因的研究。方法:设计PCR引物扩增截短型HPV58L1目的基因,将其克隆入毕赤酵母分泌表达载体pPICZαC;测序并对目的基因进行序列分析;根据毕赤酵母偏爱密码子利用反向PCR技术设计引物对目的基因进行扩增。结果:扩增了截短型HPV58L1基因并将其克隆入毕赤酵母分泌表达载体pPICZαC中;根据毕赤酵母偏爱密码子优化了截短型HPV58L1基因。结论:成功构建经密码子优化截短型HPV58L1基因的毕赤酵母分泌表达载体pPICZαC-HPV58L1。

HPV58型E6蛋白B细胞表位预测与分析

目的:预测分析高危型人乳头瘤病毒(HPV)58型E6蛋白的B细胞线性表位及其结构。方法:从瑞士生物信息研究所提供的Swissprot蛋白质数据库中检索到E6蛋白序列,采用计算机辅助生物信息学软件进行分析,用Expasy服务器在线软件分析预测E6蛋白的理化性质、二级结构及三维空间结构,采用DNASTAR软件包中的protean软件进一步分析亲水性、柔韧性、表面可及性、抗原性与极性等特性,再结合氨基酸抗原指数(AI)计算法算出平均AI,根据AI大小预测HPV58型E6蛋白的B细胞线性表位的可能肽段,并进行同源性匹配分析。结果:HPV58型E6蛋白的B细胞线性表位可能位于以下肽段位置:N端8~15(KPRTLHDL)、27~44(ELKCVECKKTLQRSEVYD)、108~127(RPLCPQEKKRHVDLNKRFHN)、141~147(RPRRRQT)肽段及其周围。同源性分析得出肽段27~44、141~147为可能的B细胞线性表位,为HPV58型E6蛋白B细胞表位的独特序列,肽段8~15与HPV33型E6蛋白同源性匹配为100%,108~127与HPV33型E6、HPV9型E6蛋白同源性匹配为100%。结论:27~44、141~147肽段为可能的HPV58型E6蛋白的B细胞优势表位。

人乳头瘤病毒58型(HPV58)主要衣壳蛋白L1的可溶性表达及应用

目的原核表达获得人乳头瘤病毒58型主要衣壳蛋白L1(HPV58 L1)并进行鉴定。方法将HPV58 L1蛋白的重组表达菌pE⁃SUMO⁃58 L1(BL21)经IPTG进行诱导表达,SDS⁃PAGE及Western blot法鉴定重组SUMO⁃58 L1蛋白的表达情况;经Ni柱纯化获得重组SUMO⁃58 L1蛋白,经泛素样蛋白酶1(ULP1)酶切去除SUMO标签获得重组HPV58 L1蛋白,红细胞凝集试验(HA)验证HPV58 L1蛋白活性;再将重组HPV58 L1蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA测定免疫血清效价,间接免疫荧光试验(IFA)检测免疫血清与HEK293T细胞瞬时表达的HPV58 L1蛋白的反应情况。结果重组蛋白SUMO⁃58 L1在大肠杆菌中可溶性表达量较高,其相对分子质量(M_(r))约72000。经Ni⁃NTA亲和纯化后,再用ULP1去除SUMO标签最终得到M_(r)约58000的HPV58 L1蛋白,该重组蛋白具有类似于HPV病毒的凝集小鼠红细胞的血凝活性,其血凝价为1∶16。ELISA测定HPV58 L1蛋白免疫小鼠血清效价最高可达1∶10240,且免疫血清可与HEK293T细胞瞬时表达的HPV58 L1蛋白发生特异反应。结论经大肠杆菌表达系统成功获得了具有血凝活性的重组HPV58 L1蛋白,其免疫血清可用于免疫细胞化学检测真核细胞表达的HPV58 L1蛋白。

宁波地区妇女宫颈感染HPV58分布与变异谱系分析

目的了解宁波地区人乳头瘤病毒高危亚型HPV58的型别分布和癌相关基因E6、E7区基因变异谱系特征。方法收集调查社区和医院就诊妇女的宫颈脱落细胞样本进行HPV分型检测,并对其中HPV58亚型阳性株进行癌相关基因测序和序列分析。结果778例社区人群样本HPV58阳性16例,检出率2.06%,1 835例就诊人群样本HPV58阳性74例,检出率4.03%;HPV58病毒株E6、E7基因序列分别成功获得6和11条,E6区有2个位点发生碱基颠换:C307T和A388C,E7区有5个位点发生碱基颠换:G694A、T726C、T744G、G761A和T803C;系统进化树分析显示宁波地区HPV58变异株主要位于该亚型基因变异谱系A的A1和A2分支。结论宁波人群HPV58感染率较高,多数感染者携带病毒的癌相关基因发生变异,应加强对人群HPV感染及其持续感染状况的监测,尤其是HPV58阳性人群。

HPV58 E2 DNA疫苗的构建及免疫原性研究

目的探讨人乳头瘤病毒58型(HPV58)早期基因E2作为DNA疫苗候选抗原的可行性。方法构建HPV58E2真核重组表达载体pcDNA3/58E2,转染SiHa细胞,利用RT-PCR检测HPV58E2mRNA的转录。pcDNA3/58E2DNA肌肉注射免疫BALB/C小鼠,ELISA检测小鼠血清中特异性anti-HPV58E2IgG水平。结果RT-PCR结果表明,pcD-NA3/58E2能够在真核细胞中有效转录HPV58E2mRNA。动物实验表明,质粒pcDNA3/58E2肌肉接种可诱导免疫小鼠产生抗E2特异性抗体。结论本研究成功构建了重组真核表达载体pcDNA3/58E2,并初步证明HPV58E2DNA疫苗有良好的免疫原性。

一种可诱发高滴度的针对人乳头瘤病毒HPV16,HPV52,HPV58中和抗体反应的HPV16嵌合病毒样颗粒疫苗的研究

人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）主要衣壳蛋白L1病毒样颗粒（VLP）主要诱发型别特异性中和抗体,增加L1VLP型别虽可扩大保护范围,但疫苗生产成本显著增加。HPV16,HPV52及HPV58是我国的主要高危型别。本文将HPV58次要衣壳蛋白L2aa.16-37多肽（与HPV52L2aa.16-37序列相同）插入HPV16L1的h4-βJ coil区,利用昆虫表达体系构建获得16L1h4-58dEVLP,协同人用佐剂氢氧化铝和单磷酰脂质A（Alum-MPL）免疫小鼠。活性检测结果显示16L1h4-58dE VLP免疫血清可中和17种HPV假病毒中的16种,其中针对HPV16的平均中和抗体滴度最高（滴度,76 800）,与HPV16L1VLP对照组的相当（P〉0.05）;重要的是,针对HPV58及HPV52的平均中和抗体滴度均大于103（分别为4 050和1 725）;另外,还可中等滴度中和HPV45（550）,HPV18（506）,HPV33（500）,HPV39（463）,HPV68（431）,HPV6（300）,HPV57（150）,HPV11（125）及较低滴度的中和HPV2/HPV27（40）,HPV35（38）,HPV5（25）,HPV31（13）,但对HPV59没有中和活性。因此,以本研究构建16L1h4-58dE VLP进行广谱HPV疫苗的研究,可望降低疫苗成本,具有应用前景。

HPV58型E1重组蛋白的表达纯化及其多克隆抗体的制备

目的：原核表达重组人类乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）58型E1蛋白，并制备兔抗HPV58型El蛋白多克隆抗体。方法：分别构建含编码E1蛋白分子中1～326aafEl却的cDNA片段的表达质粒pET－28b－E1－N，以及含编码E1蛋白分子中319～644aa（E1．c）cDNA片段的表达质粒pET－28b－E1-C原核表达载体，分别转化感受态BL21（DE3）细胞，经诱导表达后，利用镍柱亲和层析方法，分离纯化目的蛋白E1-N和E1-C作为免疫原免疫新西兰大白兔，制备抗El多克隆抗体，Western blotting检测抗体的特异性。结果：制备获得高纯度的El－N和E1－C蛋白，以及高滴度的兔抗E1多克隆抗体，Western blotting结果示，制备的多克隆抗体具有较好的抗原特异性。结论：成功获得兔抗HPV58型E1蛋白多克隆抗体，为E1蛋白分子中线性B细胞表位的鉴定提供了物质基础。

HPV58型E2蛋白表达纯化与多克隆抗体制备

目的:表达纯化重组人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)58型E2蛋白,制备多克隆抗体。方法:构建重组质粒p ET-28b-E2,转化至BL21(DE3)p Lys S中诱导表达,包涵体洗涤后经镍柱亲和层析分离得到纯化目的蛋白。用纯化的重组E2蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗HPV58型E2蛋白多克隆抗体,ELISA分析多克隆抗体的效价,免疫印迹检测抗体的特异性。结果:表达纯化了重组HPV58型E2蛋白,制备了高滴度和高特异性的多克隆抗体。结论:制备的多克隆抗体可用于对HPV58型E2蛋白进行精细B细胞线性表位鉴定。

截短型人乳头瘤病毒58型L1蛋白的表达及其体外生物活性研究

利用PCR技术克隆截短型HPV5 8L1基因并重组入杆状病毒表达系统穿梭质粒pFastBac Htb ,通过转座反应 ,将目的基因片段重组入杆状病毒基因组 ,分离重组的BacmidDNA ,并转染Sf 9昆虫细胞 ,收集被转染的Sf 9细胞 ,提取细胞蛋白 ,SDS PAGE检测可见在大约 5 8Kda处出现一新生蛋白条带 ,Westernblot证实为HPV5 8L1蛋白。用ProBondTM 纯化系统纯化所表达的蛋白。小鼠红细胞凝集试验证实纯化的蛋白可介导小鼠红细胞凝集 ,透射电镜观察证实纯化蛋白可自组装成VLP。结果表明昆虫杆状病毒表达系统可高效表达截短型HPV5 8L1蛋白 ,纯化后的截短型HPV5 8L1蛋白在体外可自组装VLP 。

HPV16、58型感染导致宫颈微环境中免疫因子变化及宫颈细胞中病毒整合的初步研究

目的：探讨人乳头状瘤病毒（Hapillomavirus,HPV）16和58型感染导致宫颈局部微环境中免疫因子白介素（Interleukin,IL）-12、IL-4,干扰素（Interferon,IFN）-γ浓度变化及宫颈细胞中HPV16/58病毒DNA整合与宫颈病变进展的关系。方法：收集2012年8月～2013年5月在广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科住院行HPV DNA分型检测,且组织病理结果诊断为宫颈癌患者的宫颈灌洗液共89例及宫颈脱落细胞140例,根据HPV分型结果将89例宫颈灌洗液分组为：1HPV16（＋）58例;2HPV58（＋）31例。应用酶联免疫法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测89例患者宫颈微环境中免疫因子IL-12、IL-4、IFN-γ的浓度;将140例宫颈脱落细胞根据HPV分型结果分组为：1HPV16（＋）106例;2HPV58（＋）34例。采用荧光定量PCR（qRT-PCR）检测HPV16/58的E2和E6基因,根据E2/E6拷贝数比值判定HPV16/58 DNA的存在状态。结果：1 HPV16（＋）组中IL-4浓度明显高于HPV58（＋）组（P〈0.05）;IL-12、IFN-γ的浓度明显低于HPV58（＋）组（P〈0.05）。2HPV16 DNA与HPV58 DNA的存在状态有着显著差异（P〈0.05）,HPV16 DNA整合比率比HPV58 DNA整合比率明显增大。结论：HPV16和58型感染不但可以导致宫颈细胞外局部免疫微环境中的IL-12、IFN-γ的降低和（或）IL-4的升高,还可导致病毒在宫颈细胞内整合,通过宫颈细胞内外变化导致宫颈病变甚至宫颈癌的发生;HPV16较HPV58更容易造成宫颈组织发生癌变。

子宫颈病变中人乳头瘤病毒基因型58流行病学特点研究进展

据报告,在2018年世界范围内有569 847例宫颈癌新发病例和311 365例死亡病例[1]。高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是宫颈癌及其癌前病变的主要致病因素。目前,已识别了200多种HPV基因型,其中约40种与生殖道感染相关,依其致癌性的不同可分为高危型HPV和低危型HPV。HPV58为高危型HPV,属于HPV16 alpha9家族,在东南亚、非洲西部及我国东南地区有较高的感染率和致癌率。因此,了解HPV58在全球范围内的流行病学特点、系统地理学分布及基因变异体,有助于分析HPV58在高发地区致癌能力增强的原因,进而阐明HPV58致宫颈癌的发病机理。研发覆盖HPV58的疫苗,预防更多的宫颈疾病,符合我国尤其是东南地区HPV58高发的国情。

妊娠期人乳头瘤病毒(HPV)感染特点的研究进展

妊娠期人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染和尖锐湿疣需要多科室协同,包括妇产科、皮肤科、儿科、耳鼻喉科等,但目前协同效率并不够高,尤其是新生儿HPV感染的远期随访、HPV潜伏感染的持续时间、幼年喉乳头状瘤的实际发生率等相关临床资料相当欠缺。本文现就妊娠期人乳头瘤病毒感染特点做一综述,现报告如下。1妊娠期HPV的感染率国外文献报告孕期HPV感染率约在5.5%~65%[1]。不同国家、地区、人群孕妇的感染率有一定差别。近年来自印度、加纳、巴西的文献报告的孕妇HPV感染率分别为39.4%、33.3%、25.3%[2~4]。国内的研究显示,对5201例孕妇进行宫颈HPV筛查,结果HPV阳性698例,感染率13.42%[5]。另一项研究显示,孕妇HPV感染率为27.74%,其中感染HPV高危亚型占阳性感染者的84.05%,感染率较高的是HPV58、52、16、53;单纯低危亚型占阳性感染者的9.20%,感染率较高的低危型是HPV6、54;高低混合感染占阳性感染的6.75%[6]。研究显示,我国正常体检女性HPV感染率为16.18%[7]。