表没食子儿茶素没食子酸酯对HPV11早期基因E6、E7mRNA表达的影响

目的利用人工构建的含人乳头瘤病毒（HPV）11型基因组的HaCaT细胞（简称为HPVll．HaCaT细胞），研究表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对该细胞生长的抑制作用，以及受试物对HPVll早期基因E6和E7mRNA表达的影响。方法在HaCaT及HPVll．HaCaT细胞培养基中添加不同浓度的EGCG后，应用MTT比色法检测受试物对细胞生长增殖的影响；用相对荧光定量PCR法检测HPVll．HaCaT细胞中HPVllE6、E7mRNA表达的改变。结果EGCG能抑制HaCaT和HPVll．HaCaT细胞的生长，不同浓度EGCG作用下，细胞生存率为52％-95％、64％～90％，呈浓度和时间依赖趋势。EGCG作用于细胞12h和24h后，HPVll．HaCaT细胞中HPVllE6、E7基因的mRNA表达水平明显下降（P〈0．05）。结论EGCG在体外能抑制含HPVll基因组的HaCaT细胞生长，并能抑制HPVll功能基因E6、E7表达。

抗HPV11/E2基因Ribozyme对靶RNA的体外剪切研究

为了寻找HPV11型引起的生殖系统感染的治疗途径和探讨HPV的致病机理 ,本实验以HPV11病毒质粒为模板 ,扩增出HPVll型E2区 6 44bp片段 ,采用pGEM T EasyVector为载体 ,构建 pTV 6 44克隆载体 ,经筛选得到克隆株 ,提取质粒测序鉴定。采用上海生化所陈农安教授编制的锤头状Ribozyme设计软件进行计算机分析 ,选择Ribozyme对靶基因的最佳剪切位点 ,及进行基因同源性分析和生物学功能分析 ,选择出针对HPVllE2靶基因的RZ2 777,在最适条件下进行体外剪切反应 ,发现人工合成和体外转录得到的Ribozyme分子均能在相应位点准确切割靶RNA分子 ,选择合适的反应条件切割效率达到 6 0 %以上 ,Km和Kcat值分别为 0 .6 3μmol/L、0 .12 μmol/L ,RibozymeL两端的 5′ cis ribozyme和 3′ cis ribozyme自我剪切释放并未影响切割活性 ,但靶RNA侧翼序列影响了Ribozyme的剪切活性。实验研究表明 ,Ribozyme可能成为治疗HPVll型引起的尖锐湿疣的有效手段 ,并有望在分子水平上开辟出基因治疗HPVll病毒感染的另一新天地。

5-ALA-PDT法在HPV11.HaCaT细胞模型中的应用

目的:确定光动力疗法(5-ALA-PDT)对携带HPV11全基因组的HaCaT细胞(HPV11.HaCaT)模型的影响。方法:HPV11.HaCaT细胞培养传代后分别用不同浓度5-ALA(0.375、0.75、1.5、3 mM),或不同剂量红光(10、20、40 J/cm^2),或不同浓度5-ALA结合不同剂量红光处理。用MTT法检测细胞增殖,实时荧光定量PCR测定HPV11早期基因E5、E6和E7 mRNA的表达。结果:0.75mM以上浓度的5-ALA联合20或40 J/cm^2红光,细胞存活率均在50%以下(P<0.01)。0.375 mM 5-ALA联合20 J/cm^2红光能明显降低HPV11 E6和E7 mRNA表达,相对表达量为0.28和0.26(P<0.01),而0.75 mM 5-ALA联合20 J/cm^2红光处理对HPV11 E6和E7 mRNA表达影响不明显,相对表达量为0.85和1.46(P>0.05),但以上两种处理条件对HPV11 E5 mRNA的表达均无明显影响。结论:5-ALA-PDT法应用于HPV11.HaC aT细胞模型能抑制HPV11.HaC aT细胞增殖,并能降低该细胞中HPV11 E6、E7mRNA的表达。