HRCA技术在转基因植物检测中的应用

超分支滚环扩增技术 (Hyperbranchedrollingcycleamplification ,HRCA)在近几年中逐渐引起人们的注意 ,并越来越多的用于基础研究和实际检测中。在本文中我们对该技术在转基因植物检测中的应用情况作了较全面的探索 ;根据 4种转基因植物中常用的外源基因或DNA片段设计了 4条锁式探针 (Padlockprobe) ,利用质粒pKK2 32 8中的一段序列作为锁式探针中的共同连接部分 ,并根据该共同的连接部分序列设计一对通用的HRCA引物 ;利用同位素标记的锁式探针对HRCA反应中的连接一步的特异性研究表明 ,只有当锁式探针和相应的检测靶DNA同时存在于连接体系中时 ,锁式探针才能被有效地进行连接 ,从线性分子变为环型分子 ,在没有相应靶DNA存在时锁式探针仅以线性形式存在 ;连接时间的研究表明 ,如果所检测的靶DNA是质粒或较短的DNA片段时 ,较短的连接时间 (5～ 10min)就可以取得理想的最终检测效果 ,如果检测的靶DNA是复杂的植物基因组DNA时 ,连接时间需要较大程度的延长 (30～ 6 0min)才能取得理想的最终检测结果 ;HRCA的反应时间研究表明 ,较长的反应时间可以明显增加最终产物的量 ;对BstDNA聚合酶大片段酶用量的研究表明 ,在其它条件不变的情况下酶的用量可以在较大的范围内变化 (0 .5u～ 4u)而不影响最终检测结果 ;?

基于HRCA的可重构SM4密码算法研究与实现

针对同时要求高吞吐率和高安全性的应用场景,提出了基于HRCA的高性能可扩展的SM4实现方案。首先,通过分析对SM4提取出的不同粒度的基础算核,提出了一个通用的粗粒度可重构计算单元;然后,为满足不同加密模式的需要给出了多种映射策略,根据不同策略将算法映射到重构计算单元;最后,通过分割控制平面和数据平面优化SM4整体架构。实验结果表明,使用所提方法,SM4算法在较低的资源消耗下吞吐量有了明显提高。

HRCA技术检测中华鳖虹彩病毒

【目的】中华鳖虹彩病毒(STIV)是甲鱼重要的病毒性病原之一,建立特异性好、灵敏度高的中华鳖虹彩病毒超分支滚环扩增体系(HRCA),对STIV进行快速、准确地检测。【方法】根据中华鳖虹彩病毒(STIV)独有的基因序列和锁式探针公共连接序列分别设计特异性的锁式探针及其扩增引物,对HRCA的系列反应条件进行优化,验证该方法的特异性和灵敏度,并用该方法对感染STIV显症和未显症的甲鱼组织进行检测。【结果】10 nmol/L探针经T4 DNA连接酶作用20 min环化,Bst DNA聚合酶大片段扩增20 min即可获得很好的检测效果。特异性试验表明,在多种待检病毒样中,HRCA能特异地检测出STIV,同时HRCA具有极高的灵敏度,能检测出的最低模板量为101拷贝,而常规PCR的检测下限为103拷贝,对显症和尚未显症的感染早期甲鱼组织的检测结果均为阳性。【结论】建立的中华鳖虹彩病毒HRCA检测体系具有灵敏、快速、简便等特点,能从组织样品中准确地检测出STIV,可以用于该类疾病的早期诊断,具有较好的推广前景。

伴有高危遗传学异常的初诊多发性骨髓瘤患者的治疗疗效及相关预后分析

在新药时代探讨伴有高危细胞遗传学异常(HRCA)的NDMM的治疗方案选择、疗效及其对疾病预后的影响。方法 回顾性纳入江苏省靖江市人民医院血液科2018年1月至2022年8月收治的50例NDMM患者,HRCA定义为FISH检出1q21扩增、P53缺失、IGH重排[对手基因为t(4;14)和t(14;16)]。比较伴随≤1种HRCA和伴随≥2种HRCA的MM患者组间临床特征及治疗疗效的差异,应用Kaplan-Meier曲线分析其对生存的影响。结果 伴随≥2种HRCA和≤1种HRCA患者比较,ISS分期晚(P=0.018),LDH值、β2微球蛋白、受累/非受累血清游离轻链比均明显高于≤1种HRCA组(P值分别为0.018、0.026、0.002),肾功能损害发生率高(P=0.035)。两组间最佳疗效和总反应率无显著差异,≤1种HRCA的患者同等治疗方案及周期下疗效更佳。同时≥2种HRCA组中位无进展生存时间和总生存时间均显著短于≤1种HRCA组(P<0.05)。结论 包括FISH在内的细胞遗传学检测在NDMM的治疗方案选择和预后评价上都有重要地位。

超混合深度可重构计算阵列调度策略的优化研究

针对一种新型的高性能计算机结构:超混合深度可重构计算机阵列(HRCA),提出两个在HRCA上任务分配的调度优化方法。(1)通过算核的优化分配减轻或消除由于算核分配引起的数据通信量急剧增加而导致的"存储墙"问题;(2)通过算粒的调度,将两次迭代间的数据交换与计算时间相重叠,缩短计算部件由数据交换导致的等待时间。以N-body FMM算法为例,验证了两种方法有效地降低了系统对于片外存储访问速度需求,提高了系统的利用率。

超分支滚环扩增技术快速检测结核分枝杆菌感染的临床应用价值

目的建立超分支滚环扩增技术(HRCA)对结核分枝杆菌的快速检测平台。方法对60例肺结核病人,38例非结核对照组和20例健康人的痰标本进行检测;同时对鸟分枝杆菌等非结核分枝杆菌检测以评价该平台的特异性。结果 HR-CA对H37Rv IS6110基因的检测灵敏度达到740 aM,检测H37Rv菌悬液的灵敏度为200 cfu/ml。鸟分枝杆菌等非结核分枝杆菌的检测结果均为阴性。60例肺结核病人检测灵敏度(73.33%,44/60)与定量PCR相近(78.33%,47/60),显著高于涂片法(41.67%,25/60),差异具有统计学意义。结论超分支滚环扩增技术是一种简单实用,结果可靠和具有较强临床应用前景的结核菌检测技术。

超分支滚环扩增试纸检测对虾黄头病毒

依据对虾黄头病毒（Yellow head virus,YHV）的非结构蛋白N基因序列,设计特异的锁式探针（Padlock probe,PLP）、检测探针及引物,建立YHV超分支滚环扩增（Hyper-branched rolling circle amplification,HRCA）检测试纸。灵敏度实验显示,YHV HRCA检测试纸能检测出的最低模板量为101拷贝,是RT-PCR灵敏度的100倍。特异性实验结果表明,该试纸能够特异性地对YHV进行检测。利用该检测试纸对进出口80批次虾样本进行检测,并将检测结果与常规RT-PCR相比较,结果显示,YHV HRCA检测试纸灵敏度方面优于常规RT-PCR方法,且操作简便、结果直观易读。

基于农田无线传感网络的分簇路由算法

由于无线传感网络节点的能量有限,如何有效地利用有限资源以及实现数据的有效传输,成为研究热点问题。针对农田区域广以及种植作物杂等环境特征,为延长农田无线传感器网络的生命周期,提高传感网的数据包投递率,构建了适用于农田信息采集的无线传感器网络架构,提出了一种混合式的分簇路由算法HCRA(hybrid clustering routing algorithm),研究了簇的形成、簇头竞选以及簇间路由过程,并对HCRA算法与低功耗自适应集簇分层型算法LEACH(low-energy adaptive clustering hierarchy),以及使用固定簇半径的混合节能分簇算法HEED(hybrid energy-efficient distributed clustering)进行了仿真试验。结果表明:在1 000次迭代周期下,采用HCRA算法的网络生存时间要比LEACH算法长约28%,比HEED算法长约12%;采用HCRA算法的数据包投递率要比LEACH算法高约34个百分点,比HEED算法高约16个百分点。该研究可为农田环境信息采集自动化监测系统提供参考。

超分支滚环扩增技术快速检测结核分枝杆菌感染的临床应用价值

目的建立超分支滚环扩增技术（HRCA）对结核分枝杆菌的快速检测平台。方法对60例肺结核病人，38例非结核对照组和20例健康人的痰标本进行检测；同时对鸟分枝杆菌等非结核分枝杆菌检测以评价该平台的特异性。结果HRCA对H37RvIS6110基因的检测灵敏度达到740aM，检测H37Rv菌悬液的灵敏度为200cfu／ml。鸟分枝杆菌等非结核分枝杆菌的检测结果均为阴性。60例肺结核病人检测灵敏度（73．33％，44／60）与定量PCR相近（78．33％，47／60），显著高于涂片法（41．67％，25／60），差异具有统计学意义。结论超分支滚环扩增技术是一种简单实用，结果可靠和具有较强临床应用前景的结核菌检测技术。

滚环扩增原理及其在医药领域的应用

滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA,还可以实现对靶核酸的信号放大,灵敏度达到一个拷贝的核酸分子,因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。本文结合了滚环扩增技术在医药领域中的最新研究进展,介绍了滚环扩增的原理及其在医药领域中的应用。

通过失活Sec途径阻遏蛋白和胞外蛋白酶提高地衣芽孢杆菌产碱性蛋白酶的能力

为了探究Sec分泌途径对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)碱性蛋白酶产量的影响,对地衣芽孢杆菌TCCC11470(BLΔuppΔepsΔpgs)中的分子伴侣阻遏蛋白基因hrcA和基因组中3个Sec途径分泌的胞外蛋白酶基因epr、bpr和vpr进行叠加敲除。通过对比分析基因缺失前后的碱性蛋白酶酶活力发现,敲除菌株TCCC11470ΔhrcA和TCCC11470ΔhrcAΔeprΔbprΔvpr在42 h的碱性蛋白酶酶活力分别达到18521.2 U/mL和20048.5 U/mL,分别高出对照菌株BLΔuppΔepsΔpgs(14478.6 U/mL)27.9%和38.5%。这一结果指出,通过改进Sec分泌通路可以显著提升碱性蛋白酶的催化效能,为构建优化的工业酶生产宿主提供了新思路和研究方向。

热休克蛋白调控机制

热休克蛋白是生物体体应对温度、pH、渗透压等不利环境刺激时合成的一种保护蛋白。在环境应激时,调控因子可以在转录水平上调控热休克基因的表达,恢复或加速清除细胞内已经变性的蛋白质,使细胞处于稳态并产生耐受性。大量研究发现,热休克调控因子对微生物应激耐受性发挥重要作用,具有广阔的应用前景。综述了6类热休克调控因子的调控机制以及相互作用,对调控因子HrcA、σ^B和CtsR进行了重点阐述,旨在为进一步构建热休克调控网络提供有价值的参考。

超分支滚环试纸检测虾传染性皮下及造血组织坏死病毒

依据传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)的非结构蛋白NS1基因序列,设计特异的锁式探针,建立IHHNV病毒超分支滚环扩增(hyper-branched rolling circle amplification,HRCA)检测方法并构建试纸条.结果表明,IHHNV HRCA试纸的检测限可以达到10拷贝/μL,较常规PCR法高约2个数量级,且能够保证对IHHNV的特异性检测.利用该试纸条对国产与进口的42份虾样本进行IHHNV检测,结果显示,HRCA试纸条在灵敏度上优于常规PCR,且方法直观、更易于结果判定.

Detection of DNA methylation by hyperbranched rolling circle amplification and DNA microarray

Aberrant DNA methylation of CpG sites has been confirmed to be closely associated with carcinogenesis.Based on the hyperbranched rolling circle amplification（HRCA） and microarray techniques,a new method for qualitative detection of methylation was developed.In the present study,padlock probes hybridize the sample DNA at the methylation site to form a probe-DNA complex which is ligated and digested simultaneously by methylation specific enzymes.Only at the methylated CpG site is the padlock probe ligated successfully to form a circle template for the HRCA reaction.Utilizing the method of 3-dimensional polyacrylamide gel-based microarray,the HRCA product will be immobilized on the slide to form a DNA microarray,which can universally hybridize the Cy3-labeled oligonucleotide probe to detect the methylation status of CpG sites.To control the false positive signals,DNA ligase and temperature of ligation/digestion are optimized.Methylation status of four CpG sites located in P15,Ecadherin,hMLH1 and MGMT genes were analyzed successfully with this method and all the results were compatible with that of methylation-specific PCR.Our research proves that this method is simple and inexpensive,and could be applied as a high-throughput tool to qualitatively determine the methylation status of CpG sites.