剑尾鱼热应激蛋白HSP70 cDNA片段的克隆与序列分析

为了进一步开展剑尾鱼Xiphophorus helleri——标准化实验动物在抗逆方面的相关研究,以及热应激蛋白(HSP70)在抗逆方面的作用,作者用RT-PCR方法首次克隆得到了剑尾鱼的HSP70的cDNA片段,该片段包含HSP70的特征性序列(GAT CTC GGT GGT GGC ACT TTT GAT)。通过将克隆片段与已发表的其它鱼类HSP70的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列进行同源性比较,发现剑尾鱼核苷酸序列同源性较高,与牙鲆Paralichthys olivaceus HSP70核苷酸序列同源性最高为89%,与川鲽Platichthys flesus、虹鳟Oncorhyn-chus mykiss和黄锡鲷Rhabdosargus sarba的同源性皆在85%以上;与国外学者发表的HSP70的规律类似,所克隆的片段与其它鱼类HSP70基因编码的氨基酸序列同源性较相应核苷酸序列同源性更高,与牙鲆和川鲽的HSP70氨基酸序列同源性最高达到99%,与斑马鱼Danio rerio、虹鳟和黄锡鲷的氨基酸序列同源性均高于97%。不同鱼的HSP70 cDNA核苷酸序列存在一定差异,但氨基酸序列并未受到影响,经对照,这种不同相当一部分存在于密码子的第3个碱基,因为密码子的简并性,编码氨基酸没有发生改变。

西伯利亚鲟热休克蛋白HSP70cDNA的克隆、序列分析和组织分布

采用普通PCR和RACE技术克隆了西伯利亚鲟Acipenser baerii热休克蛋白HSP70 cDNA的全序列,该序列全长为2 343 bp,其中5'非编码区为140 bp,3'非编码区为256 bp,可读编码框(ORF)为1 947bp,编码为648个氨基酸。该氨基酸序列中含有HSP70家族的3个特征序列——IDLGTTYS、IFDLGGGTFD-VSIL和IVLVGGSTRIPKIQK,细胞质特征性保守序列为EEVD,C端重复序列为GGMP。该cDNA序列与其它生物的HSP70 cDNA序列一样具有很高的相似性。系统发育树显示,西伯利亚鲟与非洲爪蛙蟾Xenopus laevis、密西西比短吻鳄Alligator mississippiensis、美西螈Ambystoma mexicanum的亲缘关系较近。实时定量分析结果表明,水温为17.5℃时,西伯利亚鲟肝脏、鳃、脾脏、心脏、肌肉、中肠、性腺、脑8种组织中均有HSP70表达,其中HSP70在脾脏中的表达量最高,鳃中的次之,肝脏中最低(P<0.05)。

谢氏宽漠王HSP70基因cDNA片段的克隆及热激条件下的表达

谢氏宽漠王Mantichorula semenowi Reitter是一种沙漠指示性甲虫。本研究由该种甲虫体内克隆到两种不同的HSP70基因片段,分别为MsHSP70和MsHSC70。同源性发现表明这两个基因片段与已报道的其他昆虫的热休克蛋白核苷酸序列高度同源。半定量RT-PCR分析显示：经42℃热激1h后立即诱导MsHSP70表达至最高峰;在恢复到室温的1～4h内MsHSP70表达量逐渐降低,但仍然高于未热激对照组。而MsHSC70在42℃热激1h后表达受到抑制,但在恢复2h和4h时有少量的表达,分别仅为未热激对照组的0.25和0.28倍。结果提示MsHSP70和MsHSC70在保护细胞方面具有不同的作用。本实验结果为谢氏宽漠王在极端的沙漠环境胁迫下的抗逆适应性研究提供了理论基础。

广东紫菜Hsp70基因cDNA克隆与表达分析

为探索广东紫菜(Pyropia guangdongensis)叶状体Hsp70基因在温度刺激下机体耐温相关分子机制,为广东紫菜的栽培生产提供技术参考,本研究利用RACE技术获得了广东紫菜Hsp70基因(PgHsp70)全长序列,并在此基础上采用实时荧光定量PCR技术,研究广东紫菜叶状体分别在不同温度(22℃、27℃和31℃)条件下处理0、1/6、1/2、1、6、12、24和36h后PgHsp70基因的差异表达。结果显示,PgHsp70基因序列长2004bp,包含一个1866bp的开放阅读框,可编码621个氨基酸,预测分子量为67.7kDa,理论等电点为4.87。基因表达水平定量分析表明,温度对PgHsp70基因表达水平有显著影响,PgHsp70基因在不同温度的表达水平变化趋势基本一致,均呈现先上调后下降的趋势,且均于1 h表达量到达最高水平,其中,在31℃ 1h表达量最高,为未经高温处理组的11倍,说明PgHsp70基因在应答高温胁迫中发挥着重要的作用。

栉孔扇贝热休克蛋白70基因cDNA的克隆与分析

应用表达序列标签法,获得了栉孔扇贝HSP70基因cDNA的部分序列,然后利用锚定PCR技术克隆到了该基因的全长cDNA。克隆到的HSP70 cDNA全长2553bp,编码区全长1902bp,可以编码634个氨基酸。Blast分析表明该序列与其他生物的HSP70基因具有很高的相似性。在该cDNA序列编码的氨基酸序列中含有3个HSP70家族的特征模体,结合Blast分析的结果,可以确认所获得的cDNA序列是栉孔扇贝HSP70的编码序列。该基因的克隆为进一步深入研究栉孔扇贝的抗逆机理以及指导扇贝的遗传选育和遗传改良都具有重要的理论意义。

“军牧1号”猪HSP70基因的克隆及序列分析

从"军牧1号"猪淋巴细胞中提取总RNA进行RT-PCR,将获得的HSP70cDNA克隆进pMD18-T载体,并转化至受体菌DH5α中,对阳性重组子进行DNA序列分析,结果构建的克隆质粒中含有编码HSP70的完整阅读框,它由1926个核苷酸组成,编码641个氨基酸,HSP70多肽相对分子质量为70143,C末端有高度保守的EEVD序列。与其他哺乳动物HSP70基因的同源性在81%～99%。氨基酸序列的同源性在81%～98%。与其他猪种比较,"军牧1号"猪HSP70编码基因有4个核苷酸发生替换,推定的翻译序列有2个氨基酸不同。系统进化树分析表明,"军牧1号"白猪与其他猪种的亲缘关系最近。证实了HSP70基因的高度保守性,并为HSP70的进一步研究和应用奠定了基础。

两个尼罗罗非鱼品系Hsp70基因序列比对分析

采用RT-PCR技术,对从美国和埃及引进的两个尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus品系(以下分别简称为美国尼罗和埃及尼罗)热休克蛋白70(Heat shock proteins 70,Hsp70)基因进行扩增并克隆测序。获得两个品系罗非鱼Hsp70基因完整编码区(code sequences,CDS)cDNA序列,全长为1 923 bp,编码为640个氨基酸,含有Hsp70家族3个签名序列DLGTTYS、IFDLGGGTFD和VVLVGGSTRIPKIQK,以及C末端保守序列EEVD,核定位信号标签KRKHKKDISQNKRALRR;Dank特征基序DLGTT-S-V;胞质Hsp70特征基序EEVD;靠近C端的GGMP4肽序列;2个糖基化位点NKSI和NVSA。结合BLAST分析结果,可以确认,获得的cDNA序列为美国尼罗和埃及尼罗两个品系罗非鱼的完整编码序列。序列同源性分析表明,美国尼罗和埃及尼罗有3个氨基酸位点和12个核苷酸位点不同,美国尼罗Hsp70基因氨基酸序列与莫桑比克罗非鱼同源性最高为99.7%,而与家鼠同源性最低为83.6%。

企鹅珍珠贝热休克蛋白70基因的克隆与序列比较分析

采用同源克隆和锚定PCR技术,从企鹅珍珠贝Pteria penguin中克隆到热休克蛋白hsp70基因的cDNA全序列。cDNA全长2 308 bp,3’非编码区域(UTR)为234 bp,5’UTR为118 bp,开放阅读框(ORF)为1 956 bp,编码651个氨基酸,分子量为70.97 kd,理论等电点为5.24,有2个糖基化位点:NKSI和NVSA,并含有HSP70家族的3个签名序列:IDLGTTYS,DLGGGTFD和IVLVGGSTRIPKIQK,以及C末端的保守序列EE-VD。结合BLAST分析的结果,可以确认获得的cDNA序列为企鹅珍珠贝HSP70的编码序列。与合浦珠母贝Pinctada fucata hsp70的氨基酸序列相比,企鹅珍珠贝多1个糖基化位点NVSA,少1个氨基酸,包括1个氨基酸插入和2个缺失。两者的氨基酸序列一致性高达92%,突变位点52个;两者的核苷酸序列一致性高达79%,突变位点416个。系统发育分析表明两者的亲缘关系最近,与传统分类相符,然后与太平洋牡蛎等聚合在一起。该基因的克隆和比较分析为进一步深入研究珍珠贝类的抗逆机理、抗性育种及其进化具有重要意义。

小麦返白系HSP70基因cDNA克隆及序列分析

小麦返白系是从小麦矮变1号中发现的天然突变体,为了研究其＂白化-复绿＂的分子机制,本研究以返白系FA85为材料,在前期蛋白质组学研究的基础上,采用RT-PCR技术,扩增小麦返白系HSP70基因,命名为TafHSP70（GenBank,登录号为FJ830847）,并对其蛋白质结构、序列相似性、系统进化等进行了分析研究。结果表明：小麦返白系TafHSP70的cDNA序列长度为1 272 bp,编码423个氨基酸,TafHSP70蛋白的分子质量为45 137.91 k D,理论等电点为4.94,α-螺旋和无规则卷曲是TafHSP70蛋白的主要组成部分,为弱酸性蛋白。Blastn比对和MEGA5.0软件分析表明,小麦返白系TafHSP70与节节麦的序列相似性最高,达到98%。系统进化树结果也显示,返白系不但与节节麦、二穗短柄草、大麦等禾本科植物聚为一支,而且与非禾本科的油棕、海枣、莲等也具有较高的同源性,说明HSP70具有较高的保守性。本研究有助于深入探讨HSP70的功能以及最终解析返白系的分子机制。

斯氏艾美耳球虫热休克蛋白70基因的克隆及表达分析

为了获得斯氏艾美耳球虫(E.stiedai)的热休克蛋白70(HSP70)的全基因序列,并诱导表达重组HSP70蛋白,试验根据免疫蛋白组学研究的质谱结果获得的部分氨基酸序列和已发布近源物种HSP70蛋白序列设计引物,通过c DNA末端快速扩增法(RACE)获得E.stiedai HSP70的全基因序列,将其连入原核表达载体p ET-28a(+),转化Competent Rosetta2(DE3)p Lys S,通过IPTG诱导表达重组HSP70蛋白,并进行Western-blot分析。结果表明:HSP70序列全长为2 727 bp,最大ORF为2 010 bp。HSP70在诱导后37℃培养4 h条件下有表达,但全部为不溶性表达;在诱导后20℃过夜培养条件下无表达。说明试验成功获得E.stiedai HSP70的全基因序列以及重组HSP70蛋白。

简并引物在克隆盐藻热休克蛋白70基因家族中的应用

目的 :利用简并引物扩增盐藻热休克蛋白 70 (hsp70 )家族。方法 :根据衣藻、矮牵牛花等真核生物hsp70氨基酸高度保守序列DIDLGTT ,DQGNRTTP ,PAYFNDS和ATKDAG设计 2对简并引物 ,以盐藻hsp70cDNA为模板进行巢式PCR扩增 ,产物经T -A克隆转化至JM1 0 9大肠杆菌中 ,经筛选后测序 ,将测序结果推导成氨基酸序列进行同源性分析。结果 :得到 2个分别为 372bp和 35 4bp编码 1 2 6及 1 1 8个氨基酸残基的部分cDNA片段。推导的氨基酸序列与衣藻、矮牵牛花、番茄、果蝇和酵母hsp70和hsp70b比较有高度同源性。结论 :所克隆的序列为盐藻hsp70和hsp70b部分cDNA片段。

稀有鲫热激蛋白70的分子克隆及表达特征分析（英文）

为研究稀有逗鲫(Gobiocypris rarus)HSP70用于淡水毒理学和风险评估方面的可行性,通过cDNA末端快速扩增的方法首次从稀有逗鲫肝脏中成功克隆出HSP70基因的cDNA全长,命名为GrHSP70。NCBI比对分析结果显示,GrHSP70核苷酸序列与其他鱼类的HSP70基因的核苷酸序列相似性极高,相应的氨基酸序列同源性也高(大于95%)。通过实时定量PCR获得未经污染物暴露的稀有逗鲫幼鱼体内13种组织中GrHSP70的分布以及PCP暴露后肝脏中该基因的表达图谱,结果表明GrHSP70在稀有逗鲫体内的表达呈现出组织依赖性,在性腺组织中的表达最高。此外,在不同时间﹑不同浓度的PCP暴露下稀有逗鲫肝脏中GrHSP70的表达模式呈现出显著的时间-剂量依赖效应。总之,GrHSP70可作为一种非常敏感的生物标志物,适用于中国淡水环境污染的毒理学研究及风险评估。