过表达HSPC238对Bel7402细胞周期的影响

目的:构建pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达载体,研究过表达HSPC238基因对人肝癌细胞株Bel7402细胞周期的影响。方法:采用PCR法从pET28b/HSPC238重组质粒中克隆得到HSPC238 cDNA全长序列,并将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达质粒。经酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染Bel7402细胞,随后经G418筛选4周,得到阳性克隆细胞株。用RT-PCR和Western blot技术分别检测HSPC238基因在Bel7402中的mRNA和蛋白水平的表达。随后用饥饿法使各组细胞周期同步化,再用流式细胞仪分析HSPC238过表达对细胞周期的影响。结果:pcDNA3.1(-)/HSPC238经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因HSPC238的序列完全正确;RT-PCR和Western blot检测显示,与转染pcDNA3.1(-)组和未转染组相比较,转染pcDNA3.1(-)/HSPC238组的mRNA和蛋白表达水平均明显增高,但前两者间没有差异。用饥饿法同步化后,流式细胞仪检测显示过表达HSPC238可延缓Bel7402细胞株从G1期进入S期。结论:成功构建了pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达载体,并在Bel7402中表达。初步发现过表达HSPC238可延缓肝癌细胞的细胞周期,为更进一步研究HSPC238蛋白的功能奠定了基础。

HSPC016基因重组工程菌发酵研究

目的 研究人毛乳头细胞HSPC0 16基因重组工程菌的发酵工艺。方法 采用德国B Brau公司C 10型5L发酵罐批次发酵,通过对能影响工程菌生长和目的蛋白表达的条件如不同培养基、不同葡萄糖浓度、营养物补充、pH及溶氧调节等进行优化,确定合适的培养条件和发酵工艺。结果 在优化条件下,菌体单产可达45 g/L ,目的蛋白表达量约占总蛋白的18%。结论 此发酵工艺可以提高人毛乳头细胞HSPC0 16/pET 2 8a(+ )基因重组工程菌的收获和目的蛋白表达。

HSPC238对HMOX1、RPS27a、MT2A、UBB调节的初步研究

目的:探讨HSPC238过表达或低表达对目标蛋白(HMOX1、MT2A、UBB、RPS27a)的调节作用及其调节途径。方法:分别构建HSPC238的干扰载体及高表达载体,脂质体法转染HEPG2细胞株,RT-PCR、Western blot检测HSPC238及目标蛋白的mRNA、蛋白的表达量;进一步用目标蛋白的高表达质粒分别转染低表达及高表达HSPC238的HEPG2细胞株,实验组另以蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,镍柱纯化目标蛋白,以HSPC238做免疫印迹,检测目标蛋白累积情况。结果:外源性干扰HSPC238后HMOX1、MT2A、RPS27a表达下调较明显,外源性过表达HSPC238后MT2A、UBB、RPS27a表达水平明显上调;目标蛋白的高表达质粒分别转染低表达及高表达HSPC238的HEPG2细胞株,实验组以蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后,与对照组比较,泛素化的目标蛋白条带明显增加。结论:过表达HSPC238可上调MT2A、UBB、RPS27a的表达,干扰HSPC238可下调HMOX1、MT2A、RPS27a的表达;HSPC238可能通过泛素蛋白酶体途径(Ubiquitin-proteasome pathway,UPP)对目标蛋白发挥调节作用。

HSPC238对肝癌细胞中RB基因表达的影响

目的观察HSPC238对肝癌细胞中RB mRNA和pRb蛋白水平的影响。方法将PcDNA3.1-HSPC238质粒和PLL3.7-HSPC238干扰载体分别转染HepG2细胞,用实时荧光定量PCR的方法检测RB mRNA的表达量;采用Western blotting法检测pRb蛋白的表达。结果和对照组相比,转染高表达HSPC238载体时,HepG2细胞中RB的mRNA水平和pRb表达量也增加;相反地,和对照组相比,转染低表达HSPC238载体时,HepG2细胞中RB的mRNA水平和pRb蛋白的表达量也减少。以上结果差异均有统计学意义(P<0.05)。结论在HepG2细胞中HSPC238对RB基因的表达存在正向调控作用。

抗HSPC238单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的制备抗HSPC238的单克隆抗体,为HSPC238的功能研究奠定基础。方法以纯化的重组蛋白HSPC238为抗原,免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备HSPC238单克隆抗体,并用间接ELISA法和Western-blot法对单克隆抗体的特性进行鉴定。结果成功建立两株稳定分泌抗HSPC238的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为E001和E002。ELISA检测抗HSPC238单克隆抗体的腹水效价为1∶12800和1∶25600。两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。通过Western-blot实验证实,两株单克隆抗体均能特异性结合真核细胞内源性HSPC238蛋白。结论成功制备了两株效价高、特异性好的抗HSPC238单克隆抗体,制备的抗HSPC238单克隆抗体可用于HSPC238蛋白的鉴定,为HSPC238蛋白的生物学功能研究奠定了基础。

微丝相关蛋白HSPC300／hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ相互作用的鉴定

为鉴定微丝相关蛋白HSPC300/hHBRK1在肝脏组织的功能,采用GSTpull-down结合质谱技术,检测该蛋白在肝脏中的结合蛋白,结果提示,肌球蛋白Ⅵ与HSPC300/hHBRK1共沉降,Western印迹杂交证实了质谱的结果.构建HSPC300/hHBRK1原核表达载体,诱导并获得了His-hHBRK1融合蛋白.利用免疫共沉淀证实hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ存在相互作用,激光共聚焦检测显示hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ在肺癌95D细胞的胞浆共定位,提示其相互作用可能是直接结合.肌球蛋白Ⅵ参与细胞迁移、高尔基分泌泡的运输和维持高尔基体稳定性等作用.hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ相互作用,为微丝相关蛋白HSPC300/hHBRK1参与细胞迁移和胞内物质运输提供了进一步佐证.

人毛乳头细胞HSPC016基因在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的构建人毛乳头细胞HSPC016基因的原核表达载体,诱导其表达并对目的蛋白基本生物学特性进行鉴定。方法采用PCR技术从pcDNA3.1(+)/HSPC016中扩增出195bp目的基因,克隆至pMD18-T载体,双酶切回收纯化目的片段后连接至同样酶切回收的表达载体pET-28a(+)质粒中。重组质粒经酶切及测序鉴定后转化工程菌E.coliBL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测,UVP图像扫描分析并对目的蛋白进行N-端氨基酸测序鉴定。结果采用PCR技术成功地从pcDNA3.1(+)/HSPC016中扩增出195bp目的基因,序列分析显示HSPC016基因ORF由195bp组成并与GenBank公布序列完全一致。原核表达载体pET-28a(+)/HSPC016转化工程菌E.coliBL21并经诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定:目的蛋白Mr约为7200,与理论预测值相吻合;UVP扫描表明目的蛋白表达率约20%。N-端氨基酸测序结果与预期序列完全一致。结论HSPC016基因能通过原核载体pET-28a(+)及工程菌E.coliBL21进行高效、正确地表达,为研究HSPC016基因表达的生物学意义奠定了基础。

毛乳头细胞HSPC016基因亚型全长cDNA的克隆及功能分析

目的 从人毛乳头细胞(DPC)内克隆DPC凝集性生长相关基因HSPC016的全长cDNA,分析HSPC016基因的结构与功能,探讨其对DPC生长分化的调节作用。方法 使用RACE技术从DPC内克隆HSPC016基因全长cDNA,通过生物信息学手段分析其染色体定位、蛋白序列、结构域,预测其生物功能。结果 获得两条全长cDNA序列,分别为400bp和493bp,均为HSPC016基因亚型。其染色体定位为3q21 31,是一种进化保守基因。HSPC016蛋白大小为64aa,存在于细胞核内的概率为56 7%,结构域属于PD053992家族,与核内转录调控因子T2FA的功能域同源。结论 HSPC016是一种转录调控基因,其蛋白产物可能作为转录复合体的一个亚单位,在DPC生长分化过程中通过调节其他基因的转录而发挥调控作用。

人毛乳头细胞HSPC016基因在毕赤酵母中的表达和鉴定

目的构建人毛乳头细胞HSPC016基因的真核表达载体,诱导其表达并对目的蛋白基本生物学特性进行鉴定。方法用PCR从pET-28a(+)/HSPC016中扩增出195bp目的基因,克隆至酵母表达载体pPIC9K质粒,经酶切鉴定后转化毕赤酵母菌GS115,G418-YPD平板筛选高拷贝转化子,甲醇诱导表达后进行Westernblot检测和目的蛋白N-端氨基酸测序鉴定。结果用PCR成功扩增出目的基因;pPIC9K/HSPC016转化GS115用G418-YPD平板筛选高拷贝转化子,甲醇诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定:目的蛋白相对分子量约为7·2×103,与理论预测值相吻合;UVP扫描表明目的蛋白表达率约18%;Westernblot检测具有良好的免疫反应性;N-端氨基酸测序结果与预期序列完全一致。结论HSPC016基因能通过酵母表达载体pPIC9K及宿主菌GS115进行高效、正确地表达,为研究HSPC016基因在真核细胞水平表达的生物学意义奠定了基础。

HSPC238相互作用蛋白RPL5的初步筛选

目的:构建HSPC238诱饵载体,筛选与HSPC238相互作用的目标蛋白。方法:基因合成法合成HSPC238基因,sfi IA和sfi IB双酶切后与pGBKT7诱饵载体连接,获得诱饵质粒pGBKT7-HSPC238,经测序鉴定后与酵母双杂交空质粒pGBKT7共同转化到酵母菌株AH109,在营养缺陷培养基中观察pGBKT7-HSPC238的自激活作用,进一步从人胎肝c DNA文库中筛选与HSPC238相互作用的目标蛋白。结果:诱饵载体pGBKT7-HSPC238构建成功,经表型筛选检测无自激活作用,经酵母双杂交技术结合文献分析,从人胎肝c DNA文库中初步筛选发现核糖体蛋白L5(Ribosomal protein L5,RPL5)可能是HSPC238相互作用的目标蛋白之一。结论:成功构建pGBKT7-HSPC238诱饵质粒载体,且经酵母双杂交技术结合文献分析发现RPL5可能是与HSPC238相互作用的目标蛋白之一。

膀胱癌组织中HSPC238的表达及其临床意义

目的:检测膀胱癌患者肿瘤组织中HSPC238的改变,并探讨其相关的临床意义。方法:取海南省人民医院2016年1月至2017年7月收治的膀胱癌116例,取癌旁非肿瘤组织作为对照。使用荧光定量PCR检测HSPC238基因的表达。结果:膀胱癌组织中HSPC238为0.172±0.023,显著低于对照膀胱组织的0.304±0.051(P<0.01)。HSPC238在TNM临床III,IV期患者为0.137±0.017,显著低于I,II期患者的0.194±0.028(P<0.01)。HSPC238在浸润深度达到肌层的患者为0.161±0.021,显著低于未达到肌层的0.195±0.029(P<0.05)。HSPC238在中、低分化患者为0.156±0.021,显著低于高分化的0.205±0.037(P<0.05)。HSPC238在淋巴结有转移患者为0.147±0.016,显著低于无转移的0.181±0.022(P<0.05)。结论:膀胱癌组织中HSPC238基因低表达,其表达变化可能参与膀胱癌的发生、发展、侵袭和转移。

HSPC016的表达、纯化与生物学活性分析

目的:测定大肠杆菌中造血干细胞(hematopoietic stem/progenitor cells,HSPC)016融合蛋白的表达,纯化及其生物学活性。方法:采用PCR技术从pET-28a(+)/HSPC016中扩增出目的基因HSPC016重组到质粒pET-22b(+)中,转化BL21(DE3),IPTG诱导表达,镍离子亲和层析和分子筛法纯化;用胰蛋白酶消化对数期生长的第3代和第9代DPC,细胞记数法记录生长曲线。结果:原核表达载体pET-22b(+)/HSPC016在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白表达率约28%,纯化后纯度达95%以上;经重组蛋白处理的DPC增殖活跃;细胞记数结果初步证实HSPC016重组蛋白能促进第9代DPC的增殖及其DNA合成,对第3代DPC无明显作用。结论:HSPC016基因在大肠杆菌中得到了高效表达;HSPC016重组蛋白具有促进高传代DPC增殖的作用。

HSPC238在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中的表达与意义

目的:检测HSPC238在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中的表达。方法:收集76例宫颈癌、105例CIN及28例正常宫颈标本,采用免疫组织化学的方法检测HSPC238的表达,比较不同组织中HSPC238表达的差异。结果:正常组织和癌组织中的HSPC238的表达强度无显著差异(Z=-0.242,P>0.05)宫颈上皮内瘤变组织(CINⅠ,CINⅡ,CINⅢ)与正常组织有显著差异(χ2=19.159,P<0.01),并且发现HSPC238的表达与CIN的分级存在显著相关性,随着CIN级别升高,染色程度降低(rs=-0.327,P<0.01)。结论:HSPC238的低表达与宫颈肿瘤的发生发展可能有一定关系。

干扰HSPC238对宫颈癌Hela细胞裸鼠成瘤的促进作用

目的观察干扰HSPC238对宫颈癌Hela细胞裸鼠成瘤的影响。方法将PLL3.7-HSPC238干扰载体稳定转染Hela细胞,然后将细胞接种到BALB/c裸鼠前肢腋部皮下,观察肿瘤出现时间及体积变化。结果转染了PLL3.7-HSPC238干扰载体组的裸鼠肿瘤较对照组生长快,肿瘤的体积明显大于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论干扰HSPC238对宫颈癌Hela细胞裸鼠成瘤具有促进作用。

HSPC300蛋白的表达对原发性结肠癌细胞迁移能力的影响

目的:探讨HSPC300蛋白与原发性结肠癌发生与发展的关系,及其异常表达的细胞生物学意义。方法:用免疫组织化学方法分析HSPC300蛋白在正常、腺瘤及结肠腺癌中的表达;通过体外细胞迁移系统观察异常表达的HSPC300对结肠癌细胞迁移能力的影响。结果:HSPC300在正常结肠组织中的表达阳性率为25%(5/20),在结肠腺瘤组织中为15%(3/20),结肠癌组织中为68%(15/22)。HSPC300在结肠正常组织及腺瘤组织中的表达频率显著低于腺癌(P=0.0002)。体外迁移实验表明,下调结肠癌细胞中HSPC300的表达可降低其迁移能力。结论:HSPC300在结肠癌的发生、发展过程中是一个晚期分子事件,其高表达有助于结肠癌细胞获得转移潜能。

微丝相关蛋白HSPC300/hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ相互作用位点的计算机预测

HSPC300/hHBRK1蛋白作为BRK1的人类同源蛋白,参与细胞运动和物质运输.肌球蛋白Ⅵ是肌球蛋白家族的成员.HSPC300/hHBRK1和肌球蛋白Ⅵ共同定位于细胞的胞浆,hHBRK1可能通过与肌球蛋白Ⅵ相互作用,参与细胞内的物质运输.从结构角度出发,通过计算机模拟蛋白质间相互作用,预测二者作用区域,找出相关残基PHE43,LYS105,THR676和LEU40,即可能成为相互作用位点的重要残基,为进一步实验研究提供了重要信息.

HSPC238对Hela细胞增殖和侵袭能力的影响

目的探讨高表达和干扰HSPC238对Hela细胞增殖和侵袭能力的影响。方法将pc DNA3.1-HSPC238高表达和p LL3.7-HSPC238干扰载体分别瞬时转染Hela细胞,然后采用Ed U增殖和Transwell侵袭实验,检测HSPC238对Hela细胞增殖和侵袭能力的影响。结果与对照组相比,转染了pc DNA3.1-HSPC238质粒的Hela细胞增殖和侵袭能力下降,转染了p LL3.7-HSPC238质粒的Hela细胞增殖和侵袭能力增强,以上结果均有统计学差异(P<0.05)。结论HSPC238高表达时能抑制Hela细胞的增殖和侵袭,干扰HSPC238时促进Hela细胞的增殖和侵袭。

转基因饲养层细胞体外促进脐带血CD34^+ HSPC增殖

目的构建转hOSM基因细胞系作为饲养层细胞,观察其对脐带血CD34+HSPC的扩增作用。方法用分子生物学技术建立转hOSM基因细胞系作为饲养层细胞,免疫磁珠法分离脐带血CD34+HSPC,将其与饲养层细胞共培养7 d后,流式细胞术检测其增殖,将扩增后染色的CD34+细胞移植入SC ID小鼠体内,应用荧光显微镜和RT-PCR法观察移植效果。结果CD34+HSPC与饲养层细胞共培养后扩增了9.4倍,其表面归巢相关分子CXCR4和CD54阳性率仍较高,植入小鼠体内4周后,可成功归巢到小鼠骨髓。结论建立的转hOSM基因饲养层细胞可以有效地扩增CD34+HSPC,并维持其较高的移植效率和造血活性。

HPLC-CAD法测定两性霉素B脂质体中HSPC、DSPG含量分析

目的:建立高效液相色谱(HPLC)-电喷雾检测器(CAD)法测定两性霉素B脂质体(L-AMB)中氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)和磷脂二硬酯酰磷脂酰甘油(DSPG)含量的方法。方法:采用Venusil XBP C 8(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,柱温:30℃;以甲醇-水作为流动相;喷雾压力:56.4 psi,喷雾温度:55℃;梯度洗脱,流速1.0 m L·min^(-1)。结果:L-AMB各磷脂在5~60 mg·m L^(-1)内与峰面积呈良好的线性关系。HSPC平均回收率为100.06%,平均RSD为0.42;DSPG平均回收率100.03%,平均RSD为0.55。按HPLC-CAD色谱条件测定L-AMB中HSPC、DSPG含量分别为1497.66 mg·L^(-1)、4710.93 mg·L^(-1),且无溶血磷脂检出。采用HPLC-ELSD法验证,HSPC、DSPG含量分别为1495.28 mg·L^(-1)、4712.71 mg·L^(-1),两种方法测定HSPC、DSPG含量基本一致。结论:HPLC-CAD测定L-AMB中HSPC、DSPG含量操作简单、准确,可准确测定L-AMB中脂质体的质量。