HSV1-TK自杀基因系统对小鼠肝癌细胞移植瘤的抑制效应

目的:构建表达单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV1-tk)的重组逆转录病毒,建立HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统并检测其对小鼠肝癌细胞H22移植瘤的抑制效应.方法:构建携带HSV1-tk基因的逆转录病毒载体pLXSN-tk,用PolyFectTransfection试剂介导重组逆转录病毒转染入包装细胞系PT67,通过G418筛选建立稳定产病毒的细胞株,将该重组逆转录病毒感染小鼠肝癌细胞H22,以G418筛选的抗性克隆(命名为H22/tk);将H22/tk细胞与未经基因修饰的H22细胞按1:4混合接种小鼠皮下,联合应用GCV,观察其抑瘤作用(n=19).结果:经酶切鉴定和DNA序列测定,证明HSV1-tk基因成功定向插入到pLXSN逆转录病毒载体中;重组病毒DNA转染包装细胞PT67,获取病毒滴度为4×107cfu/L的重组逆转录病毒培养液;感染小鼠肝癌细胞H22后再筛选出G418抗性克隆株H22/tk.H22/tk细胞与H22细胞混合所致荷瘤鼠在GCV治疗前,各组间肿瘤体积无显著性差异;GCV治疗后,与对照组相比,GCV治疗组肿瘤的生长明显受到抑制,到第8,10,12,14d,致瘤模型对照组的肿瘤体积分别为356±205,635±382,963±580,1509±1105mm3,而GCV治疗组分别为231±155(VS对照组,t=-2.25,P=0.03),413±252(vs对照组,t=-2.14,P=0.04),592±420(vs对照组,t=-2.38,P=0.02),939±847mm3(vs对照组,t=-1.92,P=0.06),GCV治疗组的肿瘤生长抑制率分别为35.0%,35.0%,38.5%,37.8%.结论:成功获取表达HSV1-tk基因的逆转录病毒,已建立显示出体内抑瘤活性的自杀基因治疗系统,为进一步研究中医药对自杀基因抗肿瘤的增效作用奠定基础.

HSV1-tk基因逆转录病毒载体构建、病毒包装及稳定细胞株建立

目的构建携带HSV1-tk基因的逆转录病毒载体pDON-AI-HSV1-tk,包装后产生携带相应基因的逆转录病毒并稳定感染T47D乳腺癌细胞。方法用PCR方法扩增HSV1-tk基因,利用基因重组技术构建逆转录病毒载体pDON-AI-HSV1-tk,经PCR及BamHI、SalI双酶切鉴定后与gag-pol和env表达载体用脂质体法共同转染293T包装细胞,产生含有HSV1-tk基因的逆转录病毒并用其感染T47D细胞,经G418筛选获得稳定表达株,命名为tk/T47D。结果构建了携带HSV1-tk基因的逆转录病毒载体pDON-AI-HSV1-tk,并通过PCR及BamHI、SalI双酶切证实。包装产生的逆转录病毒提取病毒基因组后PCR扩增出目的基因HSV1-tk,并成功地建立稳定表达HSV1-tk基因的T47D细胞。结论成功的构建了含有HSV1-tk基因的逆转录病毒载体并包装出携带相应基因的逆转录病毒,建立稳定表达HSV1-tk基因的乳腺癌T47D细胞株。

HSV1-tk基因的部分DNA序列分析

采用PCR技术从商品质粒pHSV10 6扩增出HSV1 tk基因 (112 8bp) ,PCR产物用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后定向克隆至真核表达载体pcDNA3,然后以重组质粒pcTK为模板 ,tk基因的 5′端引物为DNA测序引物进行部分DNA序列分析 .部分DNA序列分析证明PCR产物为HSV1 tk基因正确无误 ,成功筛选到HSV1 tk基因的真核表达载体pcTK 。

腺病毒为载体的HSV1-TK基因对肿瘤细胞系抑制作用的研究

目的:用E1区缺失的含HSV1-TK基因和CMV启动子的重组腺病毒AdE1CMVHSV1-TK(AdTK)前体药物GCV即AdTK/GCV系统,观察其在体外对PG49、H460、MCF-7、Hela4种建株肿瘤细胞系的抑制作用、旁杀伤效应和AdTK/GCV系统处理的肿瘤细胞培养上清液对肿瘤细胞的杀伤效应。方法;采用MTT法测定细胞生长抑制率,AdLacZ作为对照病毒。结果:细胞生长抑制率随重组病毒的浓度、前体药物的浓度及作用时间的增加而升高,而对照病毒则没有显示出对肿瘤细胞明显的抑制作用。旁杀伤效应显示,细胞抑制率随导入AdTK病毒的肿瘤细胞比例的增加而升高。另外肿瘤细胞呈现出上清液浓度依赖性抑制,其生长抑制率随上清液浓度的增加而升高。结论:AdTK/GCV系统对4种肿瘤细胞系有明显的抑制作用及旁杀伤效应。

HSV1-TK逆转录病毒载体构建及表达

目的 构建含ＴＫ基因逆转录病毒载体并检测其在转染细胞中的表达，为肺癌基因治疗积累实验资料。方法从 ＰＨＳＶ１０６质粒中切下约２．４ｋｂ ＴＫ基因片段，插入逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ多克隆位点，酶切筛选正、反向连接质粒。正 向连接子电穿孔法转化肺癌细胞Ａ５４９，用ＰＣＲ、细胞原位杂交法分别检测ＴＫ基因整合和表达。结果 经酶切鉴定得到 正向连接子，电穿孔法转导Ａ５４９细胞，经Ｇ４１８筛选出了转基因细胞，ＴＫ基因已整合在转染细胞中并阳性表达。结论 成功构建了含ＴＫ基因逆转录病毒载体，转导该载体的肺癌细胞可表达ＴＫ基因。

HSV1-tk 报告基因真核表达载体的构建及其在人肺腺癌 AGZY 细胞中的表达

目的：构建含有HSV1-tk（ Herpes simplex virus type 1 thymidine kinase， HSV1-tk）基因的真核表达载体，并检测其在人肺腺癌AGZY细胞系中的表达。方法应用PCR反应从质粒pHSV106质粒中扩增HSV1-tk基因后与pMD18-T载体连接，构建重组质粒pHSV1-tk/18T。将测序正确的重组质粒插入plRES2-EGFP 载体内，通过LipofectamineTM 2000将表达载体转染人肺腺癌AGZY细胞。结果酶切鉴定结果表明扩增的HSV1-tk基因序列正确；用荧光显微镜观察HSV1-tk基因的转入和表达；RT-PCR和Western blot结果显示在AGZY细胞中HSV1-tk基因在转录水平和蛋白水平均可以正确表达。MTT结果显示转染后AGZY细胞与未转染细胞在细胞增殖能力方面无明显差别。结论成功构建HSV1-tk报告基因的真核表达载体，在人肺腺癌AGZY细胞中能有效表达。

HSV1-tk基因重组逆转录病毒载体的构建与表达

通过ＤＮＡ重组技术，将ＨＳＶ１ｔｋ基因片段重组到含有ＨＳＶ１ｔｋ启动子的ｐＮ２Ａ型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组ＤＮＡ，以磷酸钙法转染ψ２，ＰＡ３１７包装细胞后，经Ｇ４１８筛选，抗性克隆细胞上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３，细胞系测定平均滴度为６．２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ，最高可达１．５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。

Tat蛋白转导结构域介导HSV1-TK导入肝癌细胞及其效应

目的：探讨HIV-1编码的反式激活蛋白Tat与HSV1-TK融合表达对肝癌细胞的杀伤效果。方法：合成编码HIV-Tat47-57（Tat 11）的2条寡核苷酸单链，两端分别引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两个酶切位点，退火形成寡核苷酸双链，15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳判断退火效果；以r-pAs16Dr为模板，通过PCR扩增HSV1-TK基因，定向克隆至原核表达载体pET-32中。将含pET-32c-Tat 11-TK的BL21菌通过IPTG诱导表达，表达产物用Ni^（2＋）螯合柱亲和纯化，免疫组化分析重组蛋白Tat 11-TK的膜结合特性，蛋白印迹技术分析该融合蛋白的穿膜能力，检测和分析TK／GCV、Tat 11-TK／GCV对肝癌细胞株HepG2的杀伤作用。结果：表达产物SDS-PAGE在相对分子质量60700左右显示条带，符合Tat 11-TK与表达标签融合蛋白的理论值，并证明以包涵体的形式表达；通过Ni^（2＋）螯合柱亲和纯化获得的Tat 11-TK重组融合蛋白，经免疫组化证实能结合到肝癌细胞表面，蛋白印迹结果说明Tat 11-TK能有效穿过细胞膜进入HepG2细胞内，同时应用低浓度前药更昔洛韦（GCV，150 μmol／L）能有效抑制HepG2细胞生长。结论：Tat 11-TK在原核系统获得高效表达，具有较强的穿膜能力和前药酶活性。

^(18)F-FHBG PET裸鼠移植瘤的HSV1-tk基因显像

制备了18F-FHBG基因探针,构建表达HSV1-tk报告基因的逆转录病毒表达载体pLXSN-tk,并建立人肝癌BEL-7402裸鼠双侧腋窝稍靠背侧皮下移植瘤模型。右侧移植瘤为实验组,左侧移植瘤为对照组,将逆转录病毒转染实验组移植瘤细胞。经裸鼠尾静脉注射18F-FHBG后,于10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210min进行PET显像。结果显示:18F-FHBG未校正放化产率为4%-10%,经放射性HPLC分析测定放化纯度>95%。对照组移植瘤放射性分布未见明显增高;实验组移植瘤于注射18F-FHBG后50-210min,PET显像见到灰阶可分辨放射性浓聚,150min前摄取值逐渐升高,150min达到高峰(摄取值为19.772kBq·mL-1),150min后摄取值快速降低。实验组移植瘤的摄取值明显高于对照组移植瘤,两组移植瘤摄取值比值达4.99。表明18F-FHBGPET报告基因显像系统可用于监测HSV1-tk基因活体内靶细胞内的表达。

含HSV1-TK基因重组腺病毒的构建及对小鼠肺癌的抑制作用

目的 观察含单纯疱疹病毒 1型胸苷激酶 (HSV1- TK)基因和 CMV启动子的重组腺病毒Ad E1 CMVHSV1- TK(Ad TK)对 L795小鼠肺癌细胞和 T739近交纯系小鼠肺癌的抑制作用。方法 采用同源重组的方法在人胚肾 2 93细胞中构建重组腺病毒 Ad TK ,用 PCR方法鉴定 ;TCID50 (5 0 %组织细胞感染量 )方法滴定病毒 ;将荷瘤小鼠分为 DMEM对照组 ,Ad L ac Z对照组 ,Ad TK实验一组 ,Ad TK实验二组 ;连续观察各组小鼠肿瘤的生长速度以及存活期。结果 PCR证实了 TK基因的导入 ;动物实验结果显示实验组小鼠瘤体的生长速度低于对照组 ,且生存期长于对照组 ,均有统计学差异。肿瘤组织病理切片显示对照组肿瘤组织比实验组生长旺盛。结论 可在人胚肾 2 93细胞中同源重组构建重组腺病毒 Ad TK,且能达到治疗有效滴度 ;Ad TK/ GCV系统对小鼠肺癌具有明显的治疗效果。

替莫唑胺联合HSV1-tk/GCV系统治疗人脑胶质瘤细胞的实验

目的探讨替莫唑胺联合HSV1-tk/GCV自杀基因系统对人胶质瘤细胞的体外杀伤作用及其作用机制。方法用携带tk基因的重组逆转录病毒转染人胶质瘤细胞系U251细胞,并筛选、鉴定。转染与未转染tk基因的U251细胞按1∶9混合。实验分3组:对照组、GCV组、GCV+TMZ组。GCV组以5种不同浓度(2、5、10、20、40μM)作用于混合细胞;GCV+TMZ组在上述基础上各加入TMZ50μM;对照组细胞不做任何处理。各组细胞培养72h后,MTT法检测各组细胞的活力,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期分布的变化。结果 (1)U251/tk细胞的活力随GCV组浓度的增加逐渐减弱,呈现良好的剂量效应关系;(2)GCV组、TMZ+GCV组的IC50分别为17.3μM、8.1μM(两组相差2.14倍);(3)GCV+TMZ组的总体抑制率显著高于GCV组(P<0.01)。GCV+TMZ组生存曲线明显左移;(4)流式细胞仪检测显示两组的凋亡率均明显增加(P<0.01);细胞多被阻滞于G2～M期。结论 HSV1-tk/GCV自杀基因系统有一定的肿瘤杀伤效应及旁观者效应;替莫唑胺与HSV1-tk/GCV自杀基因系统两者之间有明显的协同作用;其作用机制可能通过改变细胞周期的分布及促凋亡增加GCV的旁观效应。

HSV1-TK基因原核表达载体的构建及表达检测

探讨自杀基因HSV1-TK原核表达情况,为进一步将细菌载体应用于肿瘤基因治疗奠定基础。首先以质粒pHSV-106为模板,通过PCR获得HSV1-TK基因克隆并将其与原核表达载体pGEX-6P-1连接,重组质粒经鉴定后将其转化到E.coli BL21,观察其蛋白表达情况。结果表明,TK基因全长1 128 bp,与理论值相符。经测序发现插入到载体pGEX-6P-1上的DNA片段与TK基因的同源性为100%;SDS-PAGE可明显看出大小为41 ku的TK酶表达,并随时间的延长表达量不断增加。试验证明来源于单纯疱疹病毒的胸苷激酶能够实现原核表达,这一结果是应用细菌载体携带自杀基因TK治疗肿瘤的前提。

HSV1-TK报告基因显像

基因治疗中转泵的治疗基因在体内的定位、分布、持续时间和体内的表达缺乏有效的检测手段,是困扰基因治疗的一个难题。近年来,HSV1-TK报告基因显像已进行了广泛而又深入的研究,结果显示它可解决目前存在的这些问题。当前,报告基因显像的焦点是选择何种报告基因探针进行基因显像。

不同浓度载HSV1-TK基因的超声靶向微泡造影剂对HIFU治疗后裸鼠肝癌的影响

目的研究高强度聚焦超声(HIFU)治疗裸鼠肝癌后,观察不同浓度载HSV1-TK基因超声靶向微泡造影剂对裸鼠残留肝癌组织中TK基因表达的影响。方法建立裸鼠肝癌模型40只,随即分成4组,每组10只,使用JC200型HIFU治疗仪对裸鼠消融80%后,经裸鼠尾静脉注入不同浓度载基因微泡,然后用超声辐照,Real time PCR检测TK mRNA表达情况,免疫组化及Western blot检测TK蛋白的表达情况,绘制抑瘤曲线。结果免疫组化及Real time PCR及Western blot及抑瘤率均显示与A组相比,B、C、D组有统计学意义(P<0.05),而C、D组比较无统计学意义(P>0.05)。结论当携基因微泡浓度≤0.6μg/μL时,TK mRNA和蛋白的表达、抑瘤率与微泡呈浓度依赖,而当携基因微泡浓度>0.6μg/μL时,基因的表达及抑瘤率与微泡浓度无相关性,故携基因的微泡浓度为0.6μg/μL时TK基因表达最强。

绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建及活性检测

【目的】构建绿色荧光蛋白(GFP)示踪的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶基因(HSV1-tk)的重组慢病毒载体,并检测该系统对人皮肤黑色素瘤细胞株A375的感染活性。【方法】构建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重组慢病毒表达载体p LV-tk-GFP,并使用限制性内切酶消化进行鉴定及序列测定;用该重组质粒与辅助质粒共转染包装细胞HEK293T,获得重组活病毒并感染A375,以嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株;使用荧光显微镜观察GFP基因的表达,更昔洛韦(GCV)杀伤实验验证tk-GFP基因的活性。【结果】重组质粒p LV-tk-GFP经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示,tk基因已连接到载体正确位置,序列无突变;包装病毒并感染细胞后,荧光显微镜下观察显示tk-GFP基因在A375中表达;筛选得到稳定表达细胞株A375/tk-GFP,GCV能显著杀伤A375/tk-GFP细胞,表明tk基因活性正常。【结论】成功构建了重组p LV-tk-GFP慢病毒载体,该载体能包装产生活病毒且在感染的人黑色素瘤细胞株A375中tk-GFP具有生物活性。

超声微泡介导HSV1-TK／GCV自杀基因系统对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用

目的观察超声微泡（UM）介导HSV1-TK／GCV自杀基因系统对人肝癌细胞株HepG2的杀伤效率。方法将HepG2接种在培养板中，随机分为以下5组：（A）空白对照组；（B）单纯质粒组；（c）超声微泡＋质粒组；（D）超声＋质粒组；（E）超声＋超声微泡＋质粒组。转染后24h，荧光显微镜观察各组细胞绿色荧光的表达，流式细胞仪检测各组细胞的转染效率，噻唑蓝（MTT）比色法检测转染方法对HepG2活性的影响，Westernblot法检测各组细胞的TK蛋白表达；转染后24h，各组细胞加入0．0．1、1．0、10．0、50．0、100．0、500．0、1000．0mg／L共8个浓度梯度的前药更昔洛韦（GCV），72h后MTY法检测各组细胞的存活率。结果荧光显微镜下E组的绿色荧光强度明显高于其他各组；流式细胞仪检测基因转染率分别为0％、0．39％、0．61％、1．10％、36．00％，荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测提示E组tkmRNA相对表达量为1．13，是其余各组的7～9倍，Westernblot条带灰度分析显示E组TK蛋白的明显高于其他各组（P〈0．05）；转染方法对HepG2细胞活性无明显影响（P〉0．05）；GCV浓度在50mg／L以上培养72h后，低频超声＋超声微泡＋质粒组细胞几乎全部被杀灭，存活率为0，杀伤效应最强（P〈0．05），其余各组几乎无杀伤作用。结论超声破坏微泡造影剂可提高HSV1-TK基因在HepG2中的转染和表达，增强HSV1-TK／GCV自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤效应，而超声辐照和微泡造影剂在转染过程中对细胞的活性无影响。

HSV_1-TK基因转导人肺腺癌细胞A549体内外表达的研究

目的：观察ＴＫ基因转导Ａ５４９细胞后在体外和体内的表达。方法：将已构建的逆转录病毒表达载体ＰＬＸＳＮ－ＴＫ用电穿孔法转化Ａ５４９细胞，原位杂交检测ＴＫｍＲＮＡ在Ａ５４９－ＴＫ细胞和由它接种裸鼠形成肿瘤组织中的表达。斑点杂交检测外源基因在细胞中整合。并体外观察Ａ５４９－ＴＫ细胞对ＧＣＶ的敏感性。结果：原位杂交表明Ａ５４９－ＴＫ细胞及由其所形成的肿瘤组织中ＴＫｍＲＮＡ表达阳性，对照细胞无表达，斑点杂交证明Ａ５４９－ＴＫ细胞中有ＴＫ基因整合。Ａ５４９－ＴＫ细胞对ＧＣＶ的敏感性是亲代细胞的４６倍。结论：ＴＫ基因在Ａ５４９－ＴＫ细胞中表达阳性，转基因细胞对ＧＣＶ敏感。

HSV_1-TK/GCV系统对人肺腺癌细胞A549生物学特性的影响

目的 观察转TK基因肺癌细胞对丙氧鸟苷 (GCV)的敏感性及TK GCV系统杀灭肿瘤细胞机制。方法 观察转TK基因、转空载体A5 49细胞 (下分别简称A5 49 TK、A5 49 pLXSN)和A5 49细胞形态学改变、生长增殖特性。GCV对 3种细胞生长抑制 (MTT法 )。电镜、流式细胞仪观察A5 49 TK、A5 49细胞经 5 0μmol LGCV作用 3d后细胞凋亡。 结果 转基因细胞变为不规则 ,呈多角型 ,透亮度下降 ,体外增殖能力下降 ,A5 49 TK ,A5 49 pLXSN ,A5 493种细胞倍增时间分别为 42 .3 5、41.75、3 6.18h。依据IC5 0 ,A5 49 TK细胞对GCV敏感性比A5 49细胞提高 46倍 ,电镜发现A5 49 TK细胞有凋亡小体 ,核呈半月征等 ,流式细胞仪发现A5 49 TK、A5 49细胞亚G0 G1 期分别为 ( 12 .2 1± 1.76) %、( 1.3 2± 0 .47) % ,两者比较P <0 .0 1。结论 A5 49 TK细胞获得了对GCV敏感性 ,TK GCV杀灭肿瘤细胞与诱导凋亡有关。

逆转录病毒载体介导的HSV1-TK基因在人肾癌GRC-1细胞中的表达

目的 探讨HSV1 TK基因在人肾癌GRC 1细胞中表达的可能性及意义。 方法 采用基因工程技术构建带HSV1 TK基因的逆转录病毒重组体G1Na TK、用脂质体法对人肾癌GRC 1细胞进行转染及用新霉素 (neomycin)筛选。 结果 成功克隆出带HSV1 TK基因的GRC 1 /TK细胞 ,并对无环鸟苷 (ACV)敏感。 结论 HSV1 TK基因可成功转染人肾癌GRC 1细胞 ,为基因治疗肾癌提供实验依据。

HSV_1-TK/GCV系统作为肿瘤疫苗“死亡开关”的研究

背景与目的:肿瘤活疫苗有高效的抗肿瘤免疫能力,但其体内增殖性限制了进一步的临床应用。本研究将Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶/丙氧鸟苷(HSV1鄄TK/GCV)系统作为肿瘤活疫苗的“死亡开关”,以期控制疫苗在体内的存活状态,并探讨其作用机制。方法:以逆转录病毒为载体将HSV1鄄TK基因转导入大鼠卵巢癌细胞株NuTu鄄19,经G418筛选出阳性克隆后与Fischer344大鼠骨髓来源的树突细胞融合,制成携带有HSV1鄄TK基因的卵巢癌DC活疫苗(FC/TK)。以RT鄄PCR和Westernblot检测FC/TK细胞中的HSV1鄄TK表达。体外以XTT法检测不同浓度GCV对FC/TK的体外杀伤作用;以流式细胞仪和Hoechst染色法检测GCV作用5天后FC/TK的凋亡现象。体内实验中,取大鼠经足垫皮下接种FC/TK后分为两组:FC/TK+GCV组大鼠再予GCV腹腔注射7天;FC/TK+生理盐水组作为对照组。接种FC/TK后观察90天,记录注射部位有无肿瘤形成及各脏器的肿瘤转移情况。结果:FC/TK中有HSV1鄄TK的表达,在体外GCV对FC/TK的杀伤率可达86.25%,其中大于80%的FC/TK发生凋亡,并出现细胞核浓缩、边集等凋亡现象。FC/TK+生理盐水组共有3只(60%)的大鼠注射部位出现低分化腺癌;而FC/TK+GCV组未见局部肿瘤形成及脏器转移。结论:HSV1鄄TK/GCV通过诱导肿瘤活疫苗发生凋亡而起到控制其存活状态的作用。