丹参活性成分调控人肺腺癌A549细胞外泌体miRNA的变化及外泌体对HUVEC的作用

目的:检测隐丹参酮、丹参酮IIA对人肺腺癌A549细胞分泌的外泌体中内源性非编码小RNA(microRNA,miRNA)的差异表达情况。观察外泌体对HUVEC细胞的作用,并初步探索其作用机制。方法:取对数生长期的A549细胞,分别以隐丹参酮6μg/mL及丹参酮IIA 4μg/mL给药,用无血清的培养基培养24小时后,细胞上清液按照说明书提取外泌体。采用高通量测序技术,检测各组A549细胞中miRNA的表达情况,对外泌体中hsa-miR-1246进行验证,对获得的差异基因进行GO和KEGG分析。以各组外泌体加入HUVEC细胞中,并采用CCK-8实验和划痕实验,分别检测各组外泌体对HUVEC细胞的抑制作用和迁移作用,检测HUVEC细胞中CD31的基因和蛋白表达。结果:高通筛选结果发现隐丹参酮能够上调109个miRNA,下调78个miRNA;丹参酮IIA能够上调35个miRNA,下调40个miRNA。将有差异的miRNA进行功能与通路的富集分析,显示隐丹参酮、丹参酮IIA差异表达基因主要与内吞作用、癌症通路、MAPK信号通路、hippo信号通路、Wnt信号通路、癌症中的microRNAs、Rap1信号通路、肌动蛋白细胞骨架的调节等相关。细胞增殖实验发现,空白外泌体和隐丹参酮外泌体对HUVEC细胞的增殖均具有显著的抑制作用,且隐丹参酮外泌体的抑制作用明显高于空白外泌体。细胞划痕实验发现,外泌体给药后,迁移率均有显著下降,外泌体作用48 h后,隐丹参酮外泌体和丹参酮IIA外泌体作用后HUVEC的迁移率均显著低于空白外泌体。隐丹参酮处理后的A549细胞外泌体中hsa-miR-1246显著升高,而隐丹参酮外泌体作用后的HUVEC细胞中CD31的基因和蛋白的表达显著降低。结论:隐丹参酮、丹参酮IIA对A549细胞外泌体中miRNA有一定的调控作用,且富集分析与多个癌症有关信号通路相关。隐丹参酮、丹参酮IIA处理下的A549细胞外泌体对HUVEC有抑制作用,进一步从外泌体角度探析隐丹参酮及丹参酮IIA抑制血管内皮细胞增殖可能的作用机制,旨在为肺癌的治疗策略提供新的思路。

非接触共培养体系下抑制ARPE-19中CAMKⅡ表达对HUVECs迁移和侵袭及管腔形成的影响

目的:探讨非接触共培养体系下抑制人视网膜色素上皮细胞(ARPE)中Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CAMKⅡ)表达对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)迁移、侵袭、管腔形成的影响。方法:将过表达CAMKⅡ-δ的ARPE-19样本进行RNA测序,应用生物信息学分析差异基因参与的功能。使用transwell小室构建ARPE-19和HUVECs非接触共培养体系,根据实验干预措施分为:空白组:仅接种未共培养的HUVECs,无ARPE-19细胞;对照组:ARPE-19和HUVECs细胞均使用完全培养基进行共培养;AIP组(CAMKⅡ抑制组):ARPE-19使用含有AIP(160 nmol/L)的完全培养基,HUVECs使用完全培养基,进行共培养。检测HUVECs迁移、侵袭和管腔形成能力的变化,并通过Western blotting检测CAMKⅡ/AMPK/mTOR/VEGFA蛋白表达水平。结果:生信分析发现差异基因参与细胞生长与死亡和细胞运动等生物学过程。划痕和transwell迁移实验均表明AIP组的HUVECs相对迁移率均明显低于对照组(均P<0.05)。而侵袭和小管形成实验表明,AIP组的相对侵袭率和相对管腔形成率较对照组无明显改变(均P>0.05)。Western blotting结果表明AIP组CAMKⅡ、P-mTOR、VEGFA蛋白表达较对照组均明显下调,而P-AMPK蛋白表达较明显上调(均P<0.05)。结论:在非接触共培养体系下抑制ARPE-19细胞中CAMKⅡ表达可以显著降低HUVECs迁移能力,但不能改变侵袭和管腔形成能力,这可能是通过AMPK/mTOR/VEGFA信号通路实现的。

SOX7基因慢病毒载体的构建及其在缺氧条件下对HUVECs增殖与迁移功能的影响

目的构建过表达SRY-box transcription factor 7(SOX7)基因的慢病毒载体,建立SOX7基因过表达的人脐静脉内皮细胞株(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),并在常氧和缺氧条件下探究过表达SOX7对HUVECs迁移和增殖能力的影响。方法使用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术扩增SOX7基因,通过同源重组法构建以pHAGE-CMV-MCS-IRES-ZsGreen为载体的SOX7-pHAGE重组质粒。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)和免疫印迹(Western blot)法检测目的基因的mRNA和蛋白表达。将SOX7-pHAGE重组质粒和包装质粒共转染293T细胞,获得含有SOX7-pHAGE慢病毒悬液,经浓缩后感染HUVECs,构建SOX7稳定感染细胞株。应用qPCR和Western blot技术检测SOX7基因的mRNA和蛋白的表达。在常氧及缺氧条件下,通过细胞划痕实验和CCK-8法检测过表达SOX7对HUVECs迁移和增殖能力的影响。结果SOX7-pHAGE重组质粒经测序后,序列比对正确。qPCR和Western blot法成功检测出SOX7-pHAGE重组质粒转染的293T细胞在mRNA水平过表达约111.4倍(P=0.0028),在蛋白质水平上出现过表达条带;qPCR和Western blot技术成功检测到SOX7-pHAGE慢病毒感染的HUVECs在mRNA水平上显著升高约68.2倍(P=0.0030),在蛋白水平上显著升高约1.7倍(P=0.0043),SOX7-pHAGE重组质粒及SOX7稳定感染细胞株构建成功。在常氧条件下,SOX7稳定感染细胞株的迁移能力没有发生改变(P>0.9999),而在缺氧条件下其迁移能力增强约1.2倍(P=0.0044)。在常氧条件下,SOX7稳定感染细胞株的增殖能力增强约1.3倍(P=0.0087),在缺氧条件下其增殖能力也显著增强约1.4倍(P=0.0228)。结论SOX7稳定感染细胞株可促进HUVECs的增殖能力。在缺氧条件下,SOX7稳定感染细胞株可回补HUVECs被抑制的迁移和增殖能力。

大黄素调控P53/P21通路对H_(2)O_(2)诱导损伤HUVEC的保护作用

目的研究大黄素对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导损伤的血管内皮细胞(HUVEC)保护作用及作用机制。方法MTT法筛选H_(2)O_(2)造模浓度及大黄素给药浓度。取HUVEC细胞,分为正常对照组、H_(2)O_(2)模型组(终浓度100μmol/L H_(2)O_(2))和大黄素4个不同剂量(终浓度15.0、7.5、5.0、2.5μmol/L)组,置于37℃、5%CO_(2)培养箱中培养24 h。电镜和荧光显微镜观察细胞形态和结构,Hoechst法观察细胞凋亡,化学法检测各组细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)含量;Western印迹检测各组细胞中P53、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3和P21蛋白的表达。结果与正常对照组比较,模型组HUVEC细胞增殖活力显著下降;细胞形态与结构改变;SOD、NO、NOS含量显著降低;P53、caspase-3和P21蛋白表达显著提高;经不同剂量大黄素干预后,能明显改善和拮抗H_(2)O_(2)对HUVEC的氧化损伤。结论大黄素对H_(2)O_(2)诱导的HUVEC氧化损伤具有显著保护作用,其作用机制可能是调控P53/P21/caspase-3通路、抑制HUVEC氧化损伤和细胞凋亡。

Corilagin对OX-LDL诱导的HUVECs细胞损伤的保护作用及对MyD88信号通路表达的影响

目的探讨不同浓度和时间的柯里拉京(Corilagin)处理对氧化性低密度脂蛋白(oxidative low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)损伤的保护作用,以及其对MyD88信号通路表达调控的影响。方法体外培养HUVECs复制ox-LDL诱导损伤模型,利用形态学及免疫学方法鉴定HUVECs细胞,MTT法确定复制ox-LDL损伤HUVECs模型的最佳条件,根据不同处理将细胞分为正常组(Normal)、模型组(Model)、Corilagin(3.125、6.25、12.5、25、50μmol/L)组、阳性对照(VE 10μmol/L、Simvastain 1μmol/L)组。观察Corilagin对ox-LDL诱导损伤的HUVECs保护作用;Western blot和RT-qPCR方法检测HUVECs细胞中MyD88、P65、TNF-α、MCP-1表达变化。结果经形态学及免疫学方法鉴定,所培养细胞为HUVECs;70 mg/L的ox-LDL刺激12 h是复制ox-LDL损伤HUVECs模型的最佳条件;MTT结果显示,与ox-LDL组比较,Corilagin组细胞活力明显升高(P<0.01);RT-qPCR和Western blot结果表明,与Normal组比,ox-LDL组MyD88、P65、TNF-α及MCP-1的mRNA和蛋白表达升高(P<0.01);与ox-LDL组比较,Corilagin组及阳性对照组的MyD88、P65、TNF-α及MCP-1的mRNA和蛋白表达降低(P<0.01),且Corilagin组呈现剂量依赖下调MyD88、P65、TNF-α及MCP-1的mRNA和蛋白表达。结论随着时间和浓度的增加,Corilagin能明显提高ox-LDL诱导损伤的HUVECs细胞活力,其保护作用与抑制MyD88信号通路有关。

黄精多糖对脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的保护机制研究

目的:探讨黄精多糖对LPS诱导HUVEC损伤的保护作用。方法:采用HUVEC为研究对象,MTT法检测黄精多糖对LPS诱导HUVEC损伤的影响,Hoechst33258荧光染色法检测黄精多糖抗凋亡的作用效果。结果:黄精多糖与HUVEC共培养后没有引起细胞活力的明显改变,排除了实验中药物的直接细胞毒作用,通过MTT法可以发现,黄精多糖可以显著减少LPS与HUVEC共培养后,LPS对HUVEC造成的损伤(P<0.05);通过Hoechst33258荧光染色发现正常组细胞核较大且染色均匀,LPS与内皮细胞共培养后,核内可见浓染致密的颗粒状荧光,呈现出核固缩和核碎裂特征,给予黄精多糖后有所改善(P<0.05)。结论:黄精多糖具有保护LPS诱导HUVEC损伤的作用,其机制是否通过抗凋亡的途径实现有待进一步研究。

普洱茶提取物抗氧化及其对Na_2S_2O_3诱导HUVEC损伤的保护作用

利用普洱茶加工过程中废弃的碎茶灰为原料制备提取物,分析其主要化学成分组成,以ABTS和FRAP体系评价了普洱生茶、普洱熟茶提取物的抗氧化活性,并研究了这两种提取物对Na2S2O3诱导人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)损伤的保护作用。结果表明,普洱熟茶提取物中主要化学成分除咖啡碱外均低于普洱生茶提取物,其中酯型儿茶素含量减少最多。同时,普洱熟茶提取物对ABTS+清除能力和铁离子还原能力都较普洱生茶提取物作用弱,而对HUVEC损伤的保护作用却强于普洱生茶提取物,并在特定浓度下与茶多酚相当。

大气颗粒物对A549和HUVEC的DNA损伤机制

采集北京市海淀区大气颗粒物粗颗粒(PM10 2.5)、细颗粒(PM2.5 0.1)和超细颗粒(PM0.1),分析颗粒物对人肺上皮细胞(human lung epithelial cell,A549)和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)的基因毒性及促进活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)生成的机制.彗星实验发现:PM10 2.5,PM2.5 0.1和PM0.1对2种细胞均有显著的基因毒性,并呈剂量-效应关系;细和超细颗粒造成的DNA损伤显著高于粗颗粒;HUVEC细胞的DNA损伤程度大于A549细胞;PM2.5 0.1和PM0.1可诱导2种细胞内ROS水平显著升高,而PM10 2.5不能.因此细胞内DNA损伤可能与ROS生成有一定联系.

刚地弓形虫对HUVEC、Vero和J774A.1、THP-1侵入的比较研究*

目的探讨刚地弓形虫对不同类型传代细胞的侵入能力和致凋亡作用及其差异。方法实验中采用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、非洲绿猴肾成纤维细胞(Vero)、小鼠单核巨噬样细胞(J774A.1)和人单核细胞系(THP-1)细胞株。采用透射电镜和吉姆萨染色法,观察刚地弓形虫RH株侵入以上细胞的能力以及细胞骨架抑制剂秋水仙素、细胞松弛素D对其影响。用流式细胞术检测弓形虫引起的细胞凋亡。结果弓形虫RH株能侵入以上4种细胞,在胞内均有纳虫泡形成。其侵入率以J774A.1和THP-1略高。细胞骨架抑制剂细胞松弛素D可以明显降低速殖子对THP-1和J774A.1细胞的侵入率,对速殖子侵入HUVEC和Vero细胞的能力影响较小。弓形虫侵入HUVEC和J774A.1细胞均可不同程度地引起细胞凋亡和坏死,但前者以凋亡为主,后者以坏死为主。结论弓形虫可能通过不同的机制侵入非吞噬性细胞和吞噬性细胞。

尿酸钠诱导HUVEC损伤的急性痛风模型研究

目的:通过尿酸钠(MSU)体外直接刺激血管内皮细胞(HUVEC),促进胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达,建立体外急性痛风细胞模型。方法:刺激组分别用终浓度为0、25、50、75、100(μg/mL)MSU处理HU-VEC24h、48h,MTT法测定细胞活力,流式细胞仪检测HUVEC的ICAM-1表达。结果:24h时,随着MSU浓度的提高,HUVEC活力显著下降(P(0.01),同时细胞上清液中的ICAM-1表达提高;结论:100μg/mLMSU刺激HUVEC24h,造成急性痛风细胞模型。

二苯乙烯苷调节ROS相关JNK通路对LPC诱导HUVECs损伤的作用

目的探讨从何首乌提取的二苯乙烯苷(TSG)对溶血卵磷脂(LPC)诱导人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)凋亡的影响及其可能机制。方法体外培养HUVECs,筛选溶血卵磷脂损伤内皮细胞的最适药物浓度,采用CCK-8检测细胞活力,透射电镜观察细胞形态,激光共聚焦显微镜检测和观察活性氧(ROS)水平,Western blot检测p-JNK蛋白的水平。结果 LPC能引起细胞损伤,并随质量浓度增加,细胞活力降低,其中10μg/mL LPC作用细胞后,与正常组比较细胞活力明显降低,细胞内空泡增多,线粒体肿胀,产生ROS的水平增高,p-JNK蛋白表达水平显著上调。经二苯乙烯苷预处理1 h后,二苯乙烯苷1.0μmol/L和10μmol/L组与溶血卵磷脂组比较,细胞活力增强,细胞内空泡减少,线粒体较完整,产生ROS水平降低,p-JNK蛋白表达量显著下调(P<0.05)。结论二苯乙烯苷具有降低溶血卵磷脂所致HUVECs的细胞损伤作用,其机制可能与调节ROS相关JNK通路有关。

大气颗粒物对A549和HUVECs细胞的毒性作用

比较了A549和HUVECs 2种细胞对颗粒物的敏感度,以探讨大气颗粒物粒径对生物活性的影响.采集北京市区PM10～2.5、PM2.5～0.1和PM0.1,将A549和HUVECs细胞暴露于不同浓度的颗粒物悬浮液24 h后,用噻唑蓝(MTT)法测定细胞存活率,并用LDH试剂盒测定细胞培养液中LDH(乳酸脱氢酶)的含量.结果表明:随着染毒剂量的增大,细胞存活率逐渐降低,并且呈剂量-反应关系;培养液中LDH浓度呈剂量依赖型增加;当染毒剂量>200μg/mL时,PM0.1的细胞致死率大于PM10～2.5和PM2.5～0.1(P<0.01);同一粒径的颗粒物对HUVECs的毒性比A549略大,但无统计意义.因此,相对于粗颗粒物,细、超细颗粒物具有较大的细胞毒性,A549和HUVECs细胞对颗粒物的敏感度差异不显著.

丹皮酚对高血压病血瘀证患者血清损伤的HUVEC-C形态学、活性的影响

目的:观察丹皮酚(Paeonol Pea)对高血压病血瘀证患者血清损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVEC-C)形态学、活性的影响。方法:将培养的高血压病血瘀证患者血清损伤的HUVEC-C分别用不同浓度的Pea含药血清干预后,倒置显微镜下观察其形态学变化,MTT法检测其活性。结果:Pea呈剂量依赖性升高损伤的细胞OD值,且随着药物组浓度的增加,细胞的形态趋向正常细胞。结论:Pea能够抵抗高血压病血瘀证患者血清中有害因子对HUVEC-C的损伤作用,能增强细胞的活性和维持细胞的形态结构,并呈剂量依赖性。

牡丹花蕊醇提物对H2O2诱导HUVEC细胞损伤的保护作用

采用高效液相色谱分析牡丹花蕊醇提物的主要成分,并通过H2O2诱导HUVEC细胞建立损伤模型,研究牡丹花蕊醇提物对其保护作用。结果表明:牡丹花蕊醇提物主要成分为芦丁、槲皮素和芍药苷3种单体,含量分别为44.25%,15.50%,17.00%;牡丹花蕊醇提物能够降低细胞及其培养液中MDA含量,提高细胞内SOD和GPX活性以及GSH的含量。牡丹花蕊醇提物能够提高HUVEC细胞的抗氧化能力。

麦冬有效部位对HUVEC凝血与纤溶活性物质的影响

目的探讨麦冬正丁醇提取部位、薯蓣皂苷元及豆甾醇对培养HUVEC抗凝、纤溶及抗自由基损伤等作用。方法经H2O2和麦冬正丁醇提取部位、薯蓣皂苷元及豆甾醇作用于HUVEC后,取上清培养液测定tPA、PAI-1、TM的含量。结果麦冬正丁醇提取部位、薯蓣皂苷元及豆甾醇可缓解H2O2所致tPA、PAI-1的水平降低。结论麦冬有效部位可减轻自由基对HUVEC的损伤,在一定程度上通过对tPA、PAI-1含量的调节,维持内皮细胞正常生理功能,从而能有效防治血瘀证。

培养HUVEC是研究炎症介质对血管EC粘附分子调节的可靠模型

探讨培养脐静脉内皮细胞（HUVEC）模型是否适合于研究炎症介质对血管内皮细胞（EC）粘附分子的调节．方法：培养HUVEC融合成单层后以LPS1mg／L，TNF-α1×105IU／L，IL-β1×104IU／L刺激1，4，12，24h，SABC法检测细胞间粘附分子-1（ICAM-1），血小板内皮细胞粘附分子-1（PECAM-1）的表达，并进行半定量分析．结果：LPS，TNF-α，IL-1β均能迅速上调ICAM-1，PECAM-1的表达，12h达高峰，24h表达降低，对照组ICAM-1有微弱表达，PECAM-1不表达．结论：HUVEC是一用于研究炎症介质对EC粘附分子调节效应的简便、可靠的模型，也能较好地反映炎症介质对微血管EC粘附表达的影响．

地塞米松对HUVEC表达粘附分子的影响

研究地塞米松、ｒＩＬ－１ｒａ对内皮细胞表达粘附分子的影响，为炎症反应的病理过程提供理论依据。用ｒＴＮＦα、ｒＩＬ－１和ＬＰＳ诱导培养的人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ），以地塞米松或ｒＩＬ－１ｒａ处理ＬＰＳ或ｒＩＬ－１诱导的ＨＵＶＥＣ，采用Ｃｅｌ－ＥＬＩＳＡ法检测粘附分子ＩＣＭＡ－１和ＥＬＡＭ－１的表达。结果：ｒＴＮＦα、ｒＩＬ－１和ＬＰＳ提高ＨＵＶＥＣ表达ＩＣＡＭ－１和ＥＬＡＭ－１；地塞米松、ｒＩＬ－１ｒａ抑制ｒＩＬ－１诱导的粘附分子表达。表明地塞米松、ｒＩＬ－１ｒａ以不同机制抑制ＨＵＶＥＣ表达ＩＣＡＭ－１和ＥＬＡＭ－１。

绿豆皮牡荆素对H2O2损伤HUVEC细胞的预防和治疗作用

研究绿豆皮牡荆素对过氧化氢(H2O2)损伤人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的保护作用。H2O2诱导建立HUVEC细胞损伤模型,设置空白组、绿豆皮牡荆素低、中、高剂量组、VC对照组,噻唑蓝和试剂盒法分别测定细胞存活率、目标成分(MDA、GSH、SOD、LDH、GSH-Px)。最佳H2O2损伤浓度为900μmol/L此时细胞存活率为51.32%;剂量组质量浓度为60、80、100μg/mL时,细胞存活率分别为110.61%、122.30%、131.68%,不同剂量组均能显著降低细胞及培养液中MDA含量,增加GSH含量,提高SOD、GSH-Px活性;能显著提高细胞中LDH活性,降低培养液中LDH活性;绿豆皮牡荆素质量浓度为100μg/mL时,细胞保护能力与同浓度下VC相当。绿豆皮牡荆素能促进HUVEC细胞增殖,抑制自由基生成,增强抗氧化酶活性,降低细胞氧化损伤程度,且存在剂量依赖关系。

染料木黄酮对X射线辐射所致HUVEC损伤的防护作用

目的研究染料木黄酮对大剂量X射线辐射诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)氧化性损伤的防护作用。方法染料木黄酮浓度为0、5、20、50μmol/L分别于辐照前2 h预作用于HUVEC,以3.6Gy、6.0 Gy X射线照射后于24、48 h检测细胞内SOD、GSH-Px和ROS的水平变化。结果与正常对照组比较,辐照模型组HUVEC细胞内SOD、GSH-Px的含量明显降低(P<0.01),ROS含量显著增加(P<0.01),且随着辐照剂量的增加变化越明显;与辐照模型组相比,染料木黄酮给药组能明显改善辐射诱导的氧化应激引起的损伤,显著降低ROS含量,增加SOD活性(P<0.01),在一定浓度范围内,防护作用随着染料木黄酮浓度的增加而增强,且染料木黄酮对3.6 Gy辐照剂量下的防护效果优于6.0 Gy辐照剂量。与辐照模型组相比,染料木黄酮各组细胞内GSH-Px水平无显著变化(P>0.05)。结论染料木黄酮有一定的抗辐射作用,在一定浓度范围内其防护效果呈现浓度依赖性。