环状RNA mmu_circ_0001083对牛肠道病毒HY12复制的影响

环状RNA(circRNA)是一类特殊的呈闭合环状结构的非编码RNA,参与多种生物学过程,如细胞增殖、分化和凋亡,在多种疾病发生中发挥重要作用,同时也是潜在的生物标志物和治疗靶点。为探索circRNA对病毒复制的影响,本研究对HY12肠道病毒感染MC38细胞的circRNA差异表达进行了组学测定与分析,发现在HY12病毒感染后有570个circRNA表达水平上调,381个circRNA表达水平下调。在570个表达上调的circRNA中,选择差异显著上调的circRNA mmu_circ_0001083为研究对象,探讨其与HY12感染之间的关联以及对病毒复制的影响。结果显示,HY12病毒感染细胞后,宿主环状RNA mmu_circ_0001083的表达显著上升,且其表达水平呈现病毒剂量与时间依赖性。与感染正常MC38细胞相比,HY12病毒感染环状RNA mmu_circ_0001083敲低的MC38细胞后,其2C蛋白表达减少,病毒滴度显著降低。相反,HY12病毒感染过表达环状RNA mmu_circ_0001083的MC38细胞后,其2C蛋白表达增加,病毒滴度明显升高。上述结果表明,宿主环状RNA mmu_circ_0001083的表达上调与HY12病毒感染复制呈显著正相关,即mmu_circ_0001083对HY12的复制起到了正向调控的作用,该结果为今后深入研究环状RNA对HY12病毒复制的调控机制打下基础。

应用酵母双杂交技术筛选E种肠道病毒HY12-VP1蛋白的互作蛋白

为筛选E种肠道病毒HY12毒株编码VP1蛋白的宿主互作蛋白,本试验应用PCR技术扩增出HY12病毒VP1蛋白基因的完整序列,并将其克隆到酵母载体pGBKT7中,构建重组诱饵质粒pGBKT7-VP1。将重组质粒转化到酵母菌株AH109中,通过对比重组质粒组和空白质粒组不同时间点的D600值,检测其对酵母细胞的毒性,并把含有诱饵重组质粒的酵母菌涂布在缺陷型培养基上验证其自激活活性。将转有诱饵载体的AH109菌株与表达MDBK细胞的cDNA文库的Y187菌株混合培养,通过缺陷型培养基筛选杂交成功的菌落,并应用序列测定与比对分析和酵母回返试验等方法进行验证。提取阳性菌落的酵母质粒,通过缺陷型培养基及菌液PCR等方法,筛选到12个潜在HY12病毒VP1的互作蛋白,该结果为研究牛肠道病毒(BEV)感染机制及病毒结构蛋白VP1的功能等打下基础。

宿主通过激活NLRP3信号通路抑制HY12肠道病毒的复制

采用Q-PCR、Western blot和ELISA的方法检测巨噬细胞感染HY12病毒后NLRP3、IL-1β和Caspase-1等蛋白的表达水平及细胞上清中IL-1β的表达量,以确定巨噬细胞感染病毒后NLRP3通路的变化情况。同时应用IL-1β预处理小鼠原代巨噬细胞与NLRP3敲除小鼠原代巨噬细胞系,检测HY12病毒感染后细胞中病毒结构蛋白的表达水平,探究了NLRP3通路激活刺激IL-1β分泌对病毒复制的影响,并以小鼠模型进行了验证。结果显示,巨噬细胞感染HY12病毒后激活了NLRP3炎性小体信号通路,上调NLRP3、IL-1β和Caspase-1等蛋白的表达,且表达水平呈现病毒剂量与时间依赖性。同时发现IL-1β预处理的巨噬细胞感染HY12病毒后,病毒结构蛋白表达显著下降;而NLRP3敲除的小鼠巨噬细胞感染HY12病毒后,相比正常巨噬细胞感染病毒后病毒的结构蛋白表达更高。此外,与野生型小鼠感染HY12病毒相比,NLRP3敲除小鼠感染后病毒的复制明显增强。结果表明,宿主在HY12病毒感染后通过激活NLRP3信号通路及刺激IL-1β的分泌,进而抑制病毒的复制。

E种肠道病毒HY12毒株非结构蛋白3C单克隆抗体的制备与鉴定

为了研究国内分离的首株E种肠道病毒HY12毒株的非结构蛋白3C的功能,本研究以设计合成非结构蛋白3C的特异性引物,PCR扩增出3C的基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒。将构建的阳性质粒转化到大肠杆菌菌株BL21中,以IPTG诱导表达3C重组蛋白及应用尿素纯化包涵体的方法纯化重组蛋白。以纯化的3C蛋白作为免疫原免疫6周龄健康的BALB/c小鼠,经3次免疫后,采集其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经过筛选和亚克隆等过程获得能够稳定表达3C单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。应用鼠单克隆亚型鉴定试剂盒鉴定出该杂交瘤细胞株所分泌的抗体类型为IgM。以过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和间接ELISA试验鉴定该单克隆抗体的反应原性和特异性,结果表明本试验获得了HY12非结构蛋白3C的单克隆抗体能够特异性检测出牛肠道病毒抗原,为进一步研究E种肠道病毒非结构蛋白3C的功能奠定了基础。

基于MC9S12HY32的电动汽车仪表盘设计

以Freescale的S12系列16位微处理器MC9S12HY32为核心,为某电动汽车设计了一款仪表盘,实现了车速检测、步进电机控制、LCD显示、故障报警等功能。利用芯片内部资源特性设计了其硬件结构及电路,根据仪表盘的原理和工作方式设计了软件流程,并介绍了基于脉冲整形的车速信号检测的硬件设计及基于滑动时间窗口脉冲统计法的软件设计。装车试验运行稳定,有很高的实用价值。

基于MC9S12HY64的汽车双温区空调控制器的设计

本文介绍以飞思卡尔S12系列的16位微处理器MC9S12HY64为核心的双温区自动空调控制系统，包括控制装置介绍、硬件电路设计、芯片选型和PcB设计等。实现了电机控制、LCD显示、传感器采样等功能。

基于MC9S12HY64的电动车仪表盘设计

基于适用于车载仪器的微处理器MC9S12HY64设计一款电动车仪表盘,根据芯片资源特性以及MSCAN、步进电机控制器等功能模块,设计了布局简洁的硬件结构和高效的软件流程。仪表盘采用硬件信号和模拟信号双输入模式,实现了步进电机控制、LCD显示、指示灯系统、故障报警等功能,并通过CAN总线与电动车电池管理系统、车速检测设备进行数据通信。经实验测试,该仪表盘运行良好,各功能稳定,具有很高的实用价值。

基于MC9S12HY64的汽车双温区空调控制器的设计

本文介绍以飞思卡尔S12系列的16位微处理器MC9S12HY64为核心的双温区自动空调控制系统,包括控制装置介绍、硬件电路设计、芯片选型和PCB设计等。实现了电机控制、LCD显示、传感器采样等功能。

双抗体夹心ELISA检测牛肠道病毒抗原方法的建立及流行病学调查

应用大肠杆菌表达纯化的E种肠道病毒HY12 VP1和VP2重组蛋白制备的抗体,建立了检测牛肠道病毒病原的双抗体夹心ELISA方法,并对吉林省不同地区的牛群感染BEV进行了病原流行病学调查。结果,应用方阵法确定的抗VP1鼠源Ig G作为捕获抗体的最佳包被量为0.75 g/100 L,酶标抗体的最佳稀释度为1∶3 600。对大量阴性粪便样品进行了检测及其统计学处理,确定了双抗体夹心ELISA检测BEV的判定标准,样品D_（490）值≥0.143判定为阳性。特异性、敏感性等试验结果表明,所建立的检测BEV抗原方法具有特异、敏感和快速等特点。与RT-PCR方法相比,该方法操作简单快速,易在基层推广应用。对吉林省不同地区牛群粪便样品进行了检测,发现不同地区牛群的BEV感染率为8.16%~58.7%。本研究首次建立了检测BEV的双抗体夹心ELISA方法,为BEV感染的诊断、流行病学调查及本病防治提供了方法和理论依据。

从吉林省肉牛场新发疫病分离出E种肠道病毒

从吉林省某牛场发生的临床上以发热、咳嗽、呼吸困难、严重腹泻、高发病率和死亡率为特征的新发疫病病牛体内分离到大小为20～30nm和150～250nm的2株病毒。病毒生物学特性、理化学特性和分子生物学特性显示，20～30nm的病毒粒子为牛肠道病毒。该病毒命名为HYi2毒株。病毒5’端非编码区的核苷酸序列分析结果表明，HY12毒株与国外分离株SL305的同源性最高，为90％；而与国内分离毒株的同源性只有75％。系统进化树分析发现，HY12毒株属于肠道病毒属的E种肠道病毒。本研究首次在国内从临床表现为呼吸道和消化道症状的病牛体内分离出E种肠道病毒，该结果将为牛肠道病毒感染的诊断及防治提供依据。

牛肠道病毒抗体检测方法及病毒试验感染小鼠抗体消长规律

应用表达纯化的E种肠道病毒HY12VP2重组蛋白作为包被抗原,建立了检测E种肠道病毒抗体的间接ELISA方法,并对实验感染小鼠抗体消长规律进行了研究。结果表明,VP2抗原最适包被浓度为300ng/孔,抗原包被最佳条件为37℃60min;封闭条件为5%脱脂奶粉37℃封闭60min;HRP酶标二抗最适稀释度为3 000×,最佳感作条件37℃90min。通过测定阴性小鼠血清样品,确定阴性和阳性血清临界值判定标准为0.091 2。与病毒中和试验相比,间接ELISA方法敏感性高,特异性强。统计学分析显示,阳性血清和阴性血清样品板内变异系数分别为3.8%和5.2%;板间阳性和阴性样品检测百分率变异系数分别为4%和4.3%,具有良好的重复性。小鼠感染病毒1周后开始产生抗体,随后抗体滴度逐渐增加,至感染6周时,抗体滴度达到峰值,之后逐渐下降。小鼠实验感染病毒抗体消长规律为本病的免疫机理和疫苗研制打下基础。