HaNPV对红脉穗螟弱化作用的研究

在实验室条件下测试了棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigera nuclear polyhedrosis virus,HaNPV)对红脉穗螟Tirathaba rufivena Walker生长发育和繁殖力的影响。结果显示:HaNPV感染3龄幼虫6d,幼虫体长和体重分别减少37.53%和62.49%,幼虫发育历期延长11.80d,蛹重和单雌平均产卵量分别降低44.07%和90.23%;感染5龄幼虫3d,幼虫体长和体重分别减少13.02%和22.40%,幼虫发育历期延长6.58d,蛹重和单雌平均产卵量分别降低22.88%和58.44%。表明HaNPV不仅能直接杀死宿主昆虫,而且对残存活虫有很强的弱化作用。

利用赤眼蜂携带HaNPV防治棉田害虫对天敌保护作用的研究

利用赤眼蜂携带HaNPV防治棉田害虫是一种全新的生物防治技术 ,不仅在防治棉铃虫中能取得好的防治效果 ,而且天敌瓢虫、蜘蛛、草蛉、长蝽、小花蝽、猎蝽能得到有效的保护 。

用酵母双杂交系统发现HaNPV衣壳蛋白与棉铃虫肌动蛋白间的相互作用

成功的构建了棉铃虫细胞 (Hz- AM1)的 c DNA文库 (Ha- c DNA) ,然后以棉铃虫核型多角体病毒衣壳蛋白 VP39(Ha NPV- VP39)作为诱饵蛋白 ,通过酵母双杂交系统 (yeast two- hybrid system ) ,在棉铃虫细胞 c DNA文库中钓到了 VP39的相互作用因子基因 .通过 DNA测序和氨基酸序列分析表明 ,该基因为棉铃虫的肌动蛋白(actin)基因 .本实验从一个侧面反映了 VP39蛋白与棉铃虫肌动蛋白间的相互作用 .

HaNPV在宿主内的复制及其对宿主蛋白质代谢的影响

对棉铃虫Helicoverpaarmigera的中肠、血淋巴及脂肪体进行SDSPAGE蛋白质分析表明:感染早期,HaNPV对棉铃虫的蛋白质合成有刺激作用,晚期则表现出抑制作用。感染96h和120h脂肪体有较高水平的多角体蛋白合成。电镜观察表明:①HaNPV感染棉铃虫除病毒在中肠复制后经出芽进入血腔感染脂肪体等组织外,还可能存在病毒粒子直接经中肠进入血腔而感染脂肪体这样的途径;②中肠与血腔之间存在屏障结构;③中肠不仅是一次感染时病毒粒子复制的场所,它完全可能被病毒粒子二次感染。在中肠细胞中没有发现多角体的形成。

HaNPV穿梭载体的构建及绿色荧光蛋白基因在棉铃虫中的表达

ＨａＮＰＶ穿梭载体的构建及绿色荧光蛋白基因在棉铃虫中的表达＊朱应齐义鹏＊＊刘德立（武汉大学病毒研究所，武汉４３００７２）关键词棉铃虫核型多角体病毒，穿梭载体，绿色荧光蛋白基因分类号Ｑ７８，Ｓ８５２．６５杆状病毒表达载体被广泛用于表达各种外源基因．由于...

双拷贝v-cath基因的重组HaNPV的构建及毒力分析

利用HaNPV的Bac-to-Bac系统(Hanpvid)构建了双拷贝v-cath基因的重组HaNPV,即:除病毒自身的v-cath基因外,还带有由ie1启动子控制的早期表达v-cath基因的重组病毒dciHaNPV.Dotblot和Northernblot分析证明:重组病毒构建正确.用重组病毒感染Hz-AM1细胞,测定了dciHaNPV的TCID5o为3.16×107 TCID50/mL.

HaNPV病毒对寄主昆虫的持续作用研究

用不同浓度的HaNPV病毒感染3龄棉铃虫幼虫并分别收集不同处理的存活试虫进行室内传代饲养。结果表明,病毒对寄主昆虫不仅具有直接致死作用,而且对蛹质量和化蛹均有明显的影响,尤其是对亲代和子一代的寄主昆虫。同时,通过PCR技术,从子一代的幼虫和蛹中成功检测到该病毒,从而在分子水平上证明了病毒能够经过亲代传递到子代的种群中。这对病毒的高效利用和害虫的持续控制具有重要的理论和实践意义。

科云600亿PIB/克HaNPV防治棉铃虫大田药效试验

为进一步探讨科云NPV对棉铃虫的田间防治效果、对天敌的安全性，2007年用科云600亿PIB／克HaNPV水分散粒剂在棉花上进行田间药效试验，为我区棉田大面积推广应用提供依据。

Safety evaluation of microbial pesticide (HaNPV) based on PCR method

Microbial pesticides can prevent and control diseases and pests of crops, and has become one of the important measures to ensure food and environmental safety. However, the potential harm of microbial pesticides to humans and animals is a serious concern at home and abroad. In this paper, we have investigated the infectivity and pathogenicity of a representative of viral microbial pesticides, helicoverpa armigera nuclear polyhedrosis virus (HaNPV), by specific and highly sensitive polymerase chain reaction technology. The results show that HaNPV can be gradually cleared in a short time after getting into blood of experimental rats, and does not infect other tissues or organs of animals;also indicate that the test subjects are not infectious to experimental rats after intravenous injection of HaNPV. Our method has good specificity and repeatability, and could provide an important reference for establishment of infectivity and pathogenicity detection methods for viral microbial pesticides in future.

棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因5′端截短片段的表达及增效活性测定

将带有棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白 (HaGVenhancin)基因的重组表达载体 pET 30a En分别用BalⅠ和DraⅠ酶切后连接 ,构建重组表达载体pET 30a Ben和 pET 30a Den ,其外源基因的开放阅读框分别为HaGV增效蛋白基因 5′端的 1 7kb和 2 2kb。IPTG诱导表达产生 66 7kD和 85 1kD的多肽并命名为Ben和Den。初步纯化的Ben和Den显示了对棉铃虫核多角体病毒 (HaNPV)及Bt的增效活性。Ben可对棉铃虫核多角体病毒增效 1 0 5%～2 6 5% ,LT50 缩短 0 9d ,Den增效 1 0 2 %～ 33 0 % ,LT50 缩短 1 2d～ 1 9d。重组增效蛋白可对Bt(1∶2 50 0稀释 )增效 2 0 7%～ 35 4% ,Den增效 1 6 7%～ 31 5% ,Ben增效 1 1 7%～2 7 4%。

棉铃虫核型多角体病毒几丁质酶基因及杆状病毒几丁质酶基因的分子进化

用PCR方法扩增了棉铃虫Helicoverpaarmigera单粒包埋型核型多角体病毒 (HaSNPV)几丁质酶基因 ,测定了基因编码区的核苷酸全序列。基因编码区全长 1713bp,可编码 570个氨基酸残基组成的多肽 ,预计分子量为 6 3 6kD。将所推导的HaSNPV几丁质酶氨基酸序列与其它已知杆状病毒几丁质酶氨基酸序列进行联配比较 ,结果表明HaSNPV与谷实夜蛾H .zea单粒包埋型核型多角体病毒 (HzSNPV)的氨基酸序列非常相似 ,同源性高达 90 7% ,与苜蓿丫纹夜蛾Autographacalifornica多粒包埋型核型多角体病毒 (AcMNPV)、家蚕Bombyxmori核型多角体病毒 (BmNPV)、美国白蛾Hyphantriacunea核型多角体病毒 (HcNPV)、舞毒蛾Lymantriadispar多粒包埋型核型多角体病毒 (LdMNPV)、黄杉毒蛾Orgyiapseudotsugata多粒包埋型核型多角体病毒 (OpMNPV)和云杉卷叶蛾Choristoneurafumiferana核型多角体病毒 (CfMNPV)氨基酸序列同源性分别为 6 4 4 %、 6 4 9%、 6 4 2 %、 6 2 9%、 6 6 2 %和 6 1 5%。根据氨基酸序列用PC\GENE程序绘制已知杆状病毒几丁质酶的分子系统树 ,并与杆状病毒中最为保守的多角体蛋白基因系统树作了比较 ,结果表明几丁质酶基因和多角体蛋白基因的进化速率是不尽相同的。

烟夜蛾核多角体病毒对棉铃虫的毒力生物测定

在HelicoverpaassultPolyhedrosisVirus,简称 (HaNPV)对烟青虫 3龄幼虫毒力测定的基础上 ,用HaNPV 1× 10 2 ～ 1× 10 6PIB/ml 5种多角体浓度感染棉铃虫 3龄幼虫 ,测得浓度与死亡率得回归直线方程式y =3.2 7+ 0 .5 4x ,LC5 0 为 15 98PIB/ml,95 %置信界限为 6 5 0～ 392 9PIB/ml。 5种浓度的LT5 0 为 9.7、9.1、7.8、6 .9和 6 .1d。结果表明该毒株除对宿主烟青虫毒力强外 ,对棉铃虫能交叉感染 ,其敏感性和毒力虽较烟青虫有较明显的下降 ,但LC5 0 依然较低 ,表现对棉铃虫的毒力仍然较强 。

复合型甘蓝夜蛾核型多角体病毒制剂对菜粉蝶幼虫室内毒杀试验

室内试验结果显示,由甘蓝夜蛾核型多角体病毒(Mb NPV)与棉铃虫核型多角体病毒(Ha NPV)按1∶1复合而成的复剂,与甘蓝夜蛾核型多角体病毒单一制剂相比,在相同浓度下毒杀菜粉蝶幼虫效果差异显著(F复=40.38>F0.01(5,45)=3.47)。感染病毒的第6、7天测定,甘蓝夜蛾核型多角体病毒复剂对菜粉蝶幼虫的毒杀效果分别是单剂的26.6,54.53倍;浓度为2.0×105,2.0×106的复剂毒杀菜粉蝶幼虫死亡时间比相同浓度下单剂毒杀幼虫死亡时间分别提前了1.285,2.358 d。

Bt-NPV复配剂对蔬菜害虫的田间药效试验

利用甜菜夜蛾NPV(Spodoptera exigua NPV,Se NPV)、棉铃虫NPV(Helicoverpa armigera NPV,Ha NPV)分别与苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)制成复配剂,分别对甜菜夜蛾和棉铃虫2~3龄幼虫进行田间防治药效试验,同时对小菜蛾(Plutella xylostella Linnaeus)、菜粉蝶(Pieris rapae Linne)进行田间兼治。结果表明,复配剂Bt+Se NPV1对甜菜夜蛾幼虫防效,7 d和10 d分别达到78.2%和82.16%,明显高于单剂Bt的防效60.23%和63.79%;Bt+Se NPV1防治白菜田间自然发生的小菜蛾、菜青虫,10 d防效分别达到60.75%、50.58%;复配剂Bt+Ha NPV1防治温室番茄棉铃虫,7 d和10 d防效分别达到63.62%和71.40%,显著高于单剂Bt的防效53.38%和60.78%。由此可见,复配剂Bt+Se NPV1、Bt+Ha NPV1可以有效防治甜菜夜蛾、棉铃虫幼虫,防效在杀虫速度和持续性上明显高于单剂Bt;同时Bt+Se NPV1对菜田的小菜蛾、菜青虫具有一定兼治作用,可扩大复配剂防治蔬菜害虫的作用谱。

棉铃虫核型多角体病毒泰国株ORF27全长基因序列分析及其截短型基因的原核表达

目的研究棉铃虫核型多角体病毒泰国株ORF27蛋白的功能,阐释其在传代效应中可能发挥的分子机制。方法用PCR方法从棉铃虫核型多角体病毒泰国株基因组中扩增ORF27基因;使用ProtParam、TMpred、SignalP、ScanProsite等生物信息学软件分析其理化特性、亚细胞定位、信号肽、跨膜结构、功能位点等;并将其氨基端截短型基因进行原核表达。结果ORF27基因序列全长768 nt,编码255 aa,分子质量约29.5 ku。生物信息学软件预测其具有多个功能基序。截短型重组载体表达出分子质量约35 ku的外源蛋白,主要以包涵体形式存在。结论棉铃虫核型多角体病毒ORF27蛋白可能具有非常广泛的生物学活性,调控多种细胞信号传导通路,调节细胞凋亡和细胞周期,参与传代效应的发生。

棉铃虫核型多角体病毒在同源和异源寄主细胞系内复制及其感染性比较

本文对棉铃虫核型多角体病毒(Heliothis armigera Nuclear Polyhedrosis Vi-rus,HaNPV)在3个同源寄主细胞(SIE-HAH-806、SIE-Ha-798及SIE-Ha-806)和3个异源寄主细胞(TN-368、SIE-MSH-805和IPLB-SF-21AEC)内的复制及其感染性进行了比较研究。从病毒在细胞内形成多角体的历程和感染细胞百分率、TCID50滴度、病毒在感染细胞中复制的电镜检查,以及子代病毒对棉铃虫幼虫的活体感染性试验都证实,HaNPV在异源寄主细胞内复制要优于同原细胞。讨论了核型多角体病毒离体复制时,有关的同源和异源寄主细胞问题。

刚果红对棉铃虫中肠围食膜的影响及其病毒增效作用

通过观察棉铃虫幼虫正常围食膜(peritrophicmembrane,PM)的形态、结构和组成,研究了刚果红对棉铃虫幼虫围食膜的破坏作用及其对棉铃虫核多角体病毒(HaNPV)的增效作用。结果表明,棉铃虫的围食膜分布于整个中肠,包裹着食物呈液囊状,类似于Ⅰ型围食膜;健康的围食膜呈无色、透明网状结构,并具有一定韧性,经刚果红染色后呈现桔红色。使用不同浓度梯度的刚果红喂食5龄幼虫,结果显示摄取含1.5%和2.0%刚果红的饲料2.5h后,宿主不能形成完整的围食膜,而是形成易脆无弹性的围食膜碎片。经过恢复实验后发现,刚果红对围食膜的破坏作用是瞬时的,可以在较短时间内得到修复。用1.0%刚果红喂食初孵幼虫,发现1.0%刚果红对棉铃虫的幼虫生长不能产生明显的影响。1.0%刚果红能加强棉铃虫幼虫对HaNPV的敏感性,缩短病毒杀虫时间,能使5龄幼虫的病毒感染致死率达到63%,对HaNPV具有非常显著的增效作用。

PCR法证实棉铃虫核型多角体病毒对棉铃虫经卵和蛹的垂直传播

根据棉铃虫核型多角体病毒的多角体蛋白基因设计 5’引物和 3’引物 ,通过PCR技术成功扩增 389bp的目的片段 ,并对该片段进行了克隆和测序。结果表明 ,扩增片段为棉铃虫核型多角体病毒多角体蛋白基因序列。该检测方法的灵敏度为 1 0fg,应用此技术从带毒的虫卵和蛹的总DNA中也检测到该病毒的存在。

棉铃虫病毒杀虫剂新剂型——乳悬剂应用效果的评估

新研制的棉铃虫病毒(NPV)杀虫剂乳悬剂,经河南、湖北、河北3省4年棉田试验,证明防治棉铃虫的效果,相当于当前推广的化学杀虫剂,优于原病毒可湿性粉剂。乳悬剂(1.2×10^(12)～2.4×10^(12)PIB/hm^2)可使虫口减退91.7%,而 PIB 含量相同的可湿性粉剂,虫口减退率为83.7%。百株残存幼虫,前者平均为4.2头,后者为8.1头。在常温条件下,经过14～16个月的室内贮存,病毒乳悬剂的防治效果,仍达85.5%,与当年生产的病毒乳悬剂防效差异不显著。在整个棉花生长季节,使用病毒乳悬剂防治2、3、4代棉铃虫,均能有效地控制其为害。到1994年,病毒乳悬剂的应用面积已达0.87万 hm^2,具有良好的推广应用前景。

细胞松弛素D对棉铃虫核型多角体病毒复制和装配的影响

杆状病毒感染引起宿主细胞肌动蛋白骨架的构象变化 ,使之形成缆绳结构 .棉铃虫核型多角体病毒 (HaNPV)的衣壳蛋白也能使宿主昆虫的肌动蛋白发生凝聚 ,用细胞松弛素D抑制宿主肌动蛋白形成纤丝结构 ,病毒感染Hz AM1,空斑计数表明 ,0 1μg/ml细胞松弛素D可使棉铃虫核型多角体病毒的增殖下降 10 4倍 ,细胞松弛素D浓度增高到 0 5 μg/ml则测不到子代病毒粒子 .Western印迹分析表明 ,细胞松弛素D并不影响受染细胞中肌动蛋白的含量 .斑点印迹 (dotblot)也表明 ,病毒DNA的合成也没有受到影响 ,推测宿主细胞的肌动蛋白纤丝结构与病毒的复制有关 .在电子显微镜下观察超薄切片发现 ,在 0 5 μg/ml细胞松弛素D处理细胞中形成的病毒粒子形态与正常形态明显不同 ,提示细胞松弛素D抑制HaNPV的增殖是由于抑制病毒组装成完整有感染性的病毒粒子 .从而可以认为宿主昆虫细胞的丝状肌动蛋白对子代病毒的复制和组装是必需的 .