发夹式siRNA对hDNMT1基因表达的抑制作用

目的 研究发夹式siRNA对hDNMT1基因表达的抑制作用。方法 根据hDNMT1全长cDNA序列设计和合成与其互补的发夹式siRNA序列 ,并以发夹式siRNA序列为模板经体外合成siRNA表达盒 (SECs)。SECs通过脂质体载体转染结直肠癌细胞株HCT1 1 6后 ,经半定量RT PCR法检测hDNMT1mRNA的表达水平。结果 发夹式siRNA可以特异性地抑制hDN MT1基因。结论 通过SECs产生的发夹式siRNAs可以特异性抑制hDNMT1基因的表达 ;本研究为通过构建表达发夹式siR

靶向血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1基因的发卡样siRNA表达载体的构建及其效应

目的设计合成有效的靶向血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1基因的发卡样siRNA(shRNA)表达载体。方法根据siRNA的设计原则,以血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1为靶基因设计并合成小发卡结构两端配对的siRNA寡核苷酸链,再经变性、复性后形成双链血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1shRNA。采用DNA重组技术,将血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1shRNA双链与线性化pGenesil-1质粒表达载体连接,脂质体法转染人脐静脉内皮细胞株,半定量逆转录聚合酶链反应法检测血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1mRNA的表达。结果测序鉴定发现插入的发卡样序列正确,成功合成了发卡样血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1基因RNA干扰表达载体;靶向血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1基因的发卡样siRNA表达载体转染人脐静脉内皮细胞株后,其凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1mRNA的表达显著下调。结论成功构建了能有效抑制血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1mRNA表达的发卡样血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1基因RNA干扰表达载体,为进一步利用RNA干扰技术防治动脉粥样硬化提供一种研究基础。

PAI siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建和鉴定针对PAI的发卡样小干扰RNA(siRNA)真核表达载体PAI siRNA。方法人工合成一对互补并编码相应短发夹状PAIsiRNA的寡核苷酸链,将其插入到pSilencerTM2.1-U6neo载体中,经测序鉴定所构建的重组载体是否正确;采用电转染法将构建的重组载体导入人肝癌细胞HpG2中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹法分别检测转染细胞PAI mRNA和蛋白的表达。结果经测序证明PAI siRNA序列正确;转染PAI siRNA载体后,HpG2细胞PAI mRNA和蛋白表达均较对照组明显下降(P<0.01)。结论测序结果表明发卡样PAI siRNA真核表达载体构建成功,转染HpG2细胞后获得稳定表达,并可特异性封闭PAI的表达,为进一步研究PAI siRNA载体提供了实验基础。

PCR扩增的shRNA表达盒快速筛选PRRSV有效siRNA序列

有效siRNA的筛选是RNAi研究的关键点之一。本研究选取猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核衣壳蛋白(N)作为靶基因,使用http://www.ambion.com的靶位点筛选和设计工具,选取4个siRNA序列(siRNA95、siRNA179、siRNA218和siRNA294),利用一步PCR法产生包含U6启动子的短发夹RNA表达盒技术快速筛选高效siRNA,PCR法制备的shRNA表达盒(PCR-shRNA95、PCR-shRNA179、PCR-shRNA218和PCR-shRNA294)分别与表达N-EGFP融合蛋白的重组质粒pEN-ORF7共转染至293T细胞,48 h后荧光显微镜下检测细胞表达EGFP阳性率,筛选有效siRNA片段,将筛选的PCR-shRNA179的PCR产物转染N-EGFP融合蛋白稳定表达293T细胞系和PRRSV感染的Marc-145细胞,结果表明PCR-shRNA179可明显减少N蛋白的表达、有效减轻PRRSV引起的细胞病变及减少感染PRRSV的Marc-145细胞中的N蛋白阳性细胞。本研究证明一步PCR扩增shRNA表达盒法可用于筛选特异性基因表达抑制的siRNA。

pU-VEGF-siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建和鉴定针对VEGF的发卡样siRNA真核表达载体pU-VEGF-siRNA。方法人工合成一对互补并编码相应短发夹状VEGF-siRNA的寡核苷酸链,将其插入到pS ilencerTM2.1-U6neo载体中,经测序鉴定所构建的重组载体是否正确;采用电转染方法将构建的重组载体导入人恶性黑素瘤细胞系A375和人结(直)肠癌细胞系LOVO细胞中,用G418筛选得到稳定表达VEGF-siRNA的细胞;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、ELISA法分别检测转染细胞VEGFmRNA和蛋白的表达变化。结果经测序证明pU-VEGF-siRNA序列正确;G418筛选得到稳定表达VEGF-siRNA的细胞;转染pU-VEGF-siRNA载体后,A375和LOVO细胞VEGF mRNA和蛋白表达均较对照组明显下降(P<0.01)。结论测序结果表明发卡样的VEGF-siRNA真核表达载体构建成功,转染A375和LOVO细胞后获得稳定表达,并可特异性封闭VEGF的表达,为进一步研究pU-VEGF-siRNA载体在恶性黑素瘤治疗中的作用提供了实验基础。

烟草花叶病毒siRNA设计及其植物表达载体构建(英文)

RNA干扰技术已广泛应用于沉默基因表达的研究.本文分析烟草花叶病毒(TMV)基因序列,选择设计编码小分子发卡结构RNA(hpRNA)的cDNA;并根据农杆菌双元载体质粒p2355多克隆位点区限制性酶切位点,两端分别加入XbaI和BamHI酶切位点;分别合成单链DNA复性后插入到p2355上,经PCR、测序验证,表明已成功构建了具有潜在表达烟草花叶病毒siRNA的植物表达载体.

转染siRNA特异性下调人主动脉平滑肌细胞PAI表达

目的转染化学合成siRNA特异性下调人主动脉平滑肌细胞PAI表达。方法人工合成一对互补并编码相应短发夹状PAI小核糖核酸,体外退火;采用电转染方法将小RNA导入人主动脉平滑肌细胞中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、western blot法分别检测转染细胞PAI mRNA和蛋白的表达变化。结果转染PAI siRNA载体后,人主动脉平滑肌细胞PAI mRNA和蛋白表达均较对照组明显下降(P<0.01)。结论转染人主动脉平滑肌细胞后,并可快速特异性地封闭PAI的表达,为进一步研究PAI作用机制提供了实验基础。

shRNA和siRNA敲降NET-1对A431细胞生物学行为影响的比较

目的:比较小干扰RNA(small interference RNA,si RNA)和小发夹RNA(small hairpin RNA,sh RNA)敲降皮肤鳞癌细胞株(A431)中NET-1基因的表达,及其对癌细胞增殖、浸润的影响。方法:分别构建针对人NET-1基因的si RNA NET-1真核表达载体(p U6H1-GFP-si RNA NET-1,si RNA NET-1)和sh RNA真核细胞表达质粒(psilencer4.1-sh RNA NET-1,sh RNA NET-1),同时构建相应载体的随机序列(target-off)的对照质粒(sh RNA target-off和si RNA targetoff)。体外瞬时转染A431细胞,通过实时定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)、Western Blot分别检测癌细胞内NET-1 m RNA和蛋白的表达,免疫荧光染色在镜下观察NET-1蛋白在细胞内的表达;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]法和流式细胞术检测细胞增殖;划痕试验和Transwell试验分别检测A431细胞的迁移和侵袭能力,比较si RNA和sh RNA对NET-1基因的抑制效果。结果:测序证实编码NET-1序列的si RNA和sh RNA已经分别插入载体p U6H1-GFP和psilencer4.1的启动子之间,测序结果符合设计要求。转染si RNA NET-1和sh RNA NET-1后,均能显著下调A431细胞NET-1 m RNA和蛋白的表达水平,显著抑制A431细胞的增殖、迁移和浸润,与对照组(target-off)比较差异均有统计学意义(均P<0.005)。在细胞生长曲线分析中显示转染sh RNA NET-1组在72 h后抑制细胞增殖的效果强于si RNA NET-1组。结论:NET-1基因的功能与A431细胞增殖、迁移、浸润有关。靶向NET-1的si RNA和sh RNA真核表达载体均能特异、有效地下调NET-1基因的功能。sh RNA介导的RNAi作用能更长期、稳定的抑制目的基因的表达,更适合于对目的基因功能进行长期研究。

靶向X基因shRNA特异抑制HBV基因表达和复制

目的:研究针对HBV X基因小发夹RNA(shRNA)对HBV基因表达和复制的抑制作用。方法:利用分子克隆方法构建了4个HBV X基因特异性shRNA的表达质粒pshHBx1-4,与HBV复制性质粒共转染HepG2细胞,Northern和Southern印迹法检测HBV的mRNA和病毒复制中间体,化学发光微粒免疫分析方法检测细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg,免疫荧光染色分析细胞HBcAg的表达水平。结果:共转染pshHBx1-4显著抑制HBV mRNA表达、降低细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的水平和细胞内HBcAg的表达水平、并有效抑制HBV的病毒复制中间体的合成。结论:HBV X基因特异性的shRNA可以有效抑制HBV的基因表达和病毒复制,有可能发展成为新的抗HBV制剂。

下调PAI对HpG2细胞VEGF表达的影响

目的探讨PAI的发卡样siRNA真核表达载体PAI siRNA对人肝癌HpG2细胞VEGF表达的影响。方法设计短发夹状PAI siRNA的寡核苷酸链,将其插入到真核细胞表达载体pSilencerTM 2.1-U6 neo载体中,构建的重组载体后;采用脂质体转染方法将构建的重组载体导入人肝癌细胞HpG2中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、westernblot法分别检测转染细胞PAI mRNA和蛋白的表达变化以及对VEGF表达的影响。结果经测序证明PAI siRNA序列正确;转染PAI siRNA载体后,HpG2细胞PAI mRNA和蛋白表达均较对照组明显下降(P<0.01)。转染后,细胞中PAI含量降低,V EGF的表达也减少。结论测序结果表明发卡样的PAI siRNA真核表达载体构建成功,转染HpG2细胞后获得稳定表达,并可特异性封闭PAI的表达,PAI siRNA能有效阻断PAI的蛋白合成,同时抑制细胞中V EGF的表达。

小发夹RNA在稀有鮈鲫胚胎中的表达

由小的干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来快速发展的一种转录后基因沉默方法,已被广泛的应用于基因功能的研究,基因网络调控的探讨以及疾病的治疗等方面。多数的siRNA表达载体依赖RNA聚合酶Ⅲ启动子中的一种,操纵一段短发夹结构RNA(Small hairpin RNA,shRNA)在细胞或体内表达。这一类启动子主要包括人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子等。为了探明鱼类自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子是否能有效驱动shRNA在鱼体内表达,从而更好地利用RNAi进行鱼类基因功能和抗病毒研究,研究利用斑马鱼的H1和U6启动子以及草鱼的H1启动子,以草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)外衣壳蛋白VP7基因为靶基因,以增强型绿色荧光蛋白(eGFP)为报告基因,分别构建了三个shRNA表达载体:pZH1siGCRV-CMVeGFP、pZU6siGCRV-CMVeGFP和pCH1siGCRV-CMVeGFP。通过显微注射将三种表达载体分别导入稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)受精卵中。由于siRNA片段很短,其表达检测非常困难,研究采用stem-loop RT-PCR方法,对稀有鮈鲫胚胎发育不同时期的shRNA表达进行了检测。研究结果表明,采用的三种鱼类自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子均能有效驱动GCRVsiRNA的表达;在取样的各个胚胎发育时期均能检测到GCRV siRNA的表达;stem-loop RT-PCR方法可以便捷检测siRNA的表达。研究构建的鱼类胚胎siRNA有效持续表达载体,建立的简易快捷siRNA检测方法,为进一步的抗GCRV转基因鱼研制以及siRNA的病毒复制干扰机制研究奠定了重要基础并提供有力的技术支撑。

LOX-1特异性小发夹RNA表达载体的构建及其对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响

目的:靶向血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)基因的发卡样siRNA(shRNA)表达载体的构建及其对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响。方法:(1)采用DNA重组技术,将LOX-1shRNA双链与线性化pGenesil-1质粒表达载体连接,构建LOX-1特异性小发夹RNA表达载体pLOX-1-shRNA1及pLOX-1-shRNA2,用脂质体法转染小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7),半定量逆转录聚合酶链反应法检测LOX-1mRNA的表达,Western blot法检测LOX-1蛋白的表达,选择沉默效果最佳的作为下一步的干预序列。(2)ox-LDL诱导巨噬细胞建立泡沫细胞模型,pLOX-1-shRNA进行干预,干预组使用脂质体法进行细胞转染,转染24小时后,再加入ox-LDL作用24小时,用油红O染色法及细胞内游离胆固醇及总胆固醇测定法观察对泡沫细胞形成的影响,倒置荧光显微镜观察RAW264.7细胞对Dil-ox-LDL的摄取率。结果:测序鉴定发现插入的发卡样序列正确,成功合成了发卡样LOX-1基因RNA干扰表达载体,pLOX-1-shRNA1及pLOX-1-shRNA2转染RAW264.7细胞后,其LOX-1基因和蛋白表达显著下调,并且以pLOX-1-shRNA2沉默效果最佳。结论:成功构建了能有效抑制LOX-1基因及蛋白表达的干扰表达载体,同时可抑制巨噬细胞源性泡沫细胞形成及对Dil-ox-LDL的摄取,为进一步利用RNA干扰技术防治动脉粥样硬化提供理论基础。

si-DNMT1对肝门部胆管癌细胞抑癌基因甲基化的作用

目的研究RNA干扰对肝门部胆管癌细胞株QBC939抑癌基因甲基化的影响,初步探讨其在胆管癌治疗中的价值。方法构建靶向hDNMT1的发夹式siRNA表达载体;运用脂质体介导法将其转染人胆管癌细胞QBC939;RT-PCR法检测不同时间点hD-NMT1、CDH1、p15的表达水平;MSP方法检测转染前后抑癌基因CDH1、p15的甲基化状态;MTT检测各组细胞的增殖能力。结果 1)hDNMT1的基因沉默恢复了抑癌基因CDH1、p15的表达水平;2)CDH1、p15的表达沉默是由启动子高甲基化导致的;3)转染靶向hDNMT1的发夹式siRNA表达载体能有效地抑制QBC939的增殖能力。结论靶向hDNMT1的发夹式siRNA表达载体能有效、持续、稳定发挥对hDNMT1的基因沉默作用,恢复抑癌基因CDH1、p15的表达水平,从而抑制QBC939肿瘤细胞增殖。

Applications of RNA interference highthroughput screening technology in cancer biology and virology

RNA interference （RNAi） is an ancient intra-cellular mechanism that regulates gene expression and cell function. Large-scale gene silencing using RNAi highthroughput screening （HTS） has opened an exciting frontier to systematically study gene function in mammalian cells. This approach enables researchers to identify gene function in a given biological context and will provide considerable novel insight. Here, we review RNAi HTS strategies and applications using case studies in cancer biology and virology.