多形汉逊酵母外源基因表达系统

多形汉逊酵母是一种有很大潜力的外源基因表达系统 ,已在科研和工业化生产上广泛应用。用它生产来源于真核生物的外源基因有许多优点 ,如重组菌减数分裂稳定、能进行正确的翻译后加工和修饰、表达量高等。许多有商业价值的蛋白质在这一系统中得到成功表达 ,有的已投入市场。本文综述多形汉逊酵母宿主菌的生物学特性、基因工程操作技术。

荧光定量PCR法检测重组汉逊酵母中HBsAg基因的拷贝数

重组汉逊酵母基因中外源基因拷贝数是影响目的基因表达水平和检测传代稳定性的重要因素,因此外源基因拷贝数的检测成为研究和分析重组基因的重要内容。利用快速、灵敏的荧光定量PCR法检测外源基因HBsAg拷贝数,以Mox基因为内源参照基因,通过梯度稀释法,建立了Mox基因和HBsAg基因的循环数(Ct值)与起始模板数的相关标准曲线,其相关系数分别达到0.9996和0.9982。通过比较目的基因HBsAg和内源参照基因Mox在同一荧光强度下出峰的循环数,获得了目的基因HBsAg在重组汉逊酵母中的拷贝数为39。发酵前后HBsAg基因在重组汉逊酵母中稳定存在,发酵前后拷贝数相差均小于6.2%。本方法快速、简便、准确,可以满足基因拷贝数检测的需要。

马动脉炎病毒主要结构蛋白基因酵母工程菌的构建及鉴定

目的:构建马动脉炎病毒读码框ORF5、ORF6、ORF7主要结构蛋白基因全长片段的克隆载体及汉逊酵母穿梭载体,并获得重组工程菌,为下一步酵母表达重组目的蛋白奠定基础。方法:应用RT-PCR方法从病毒核酸中扩增ORF5、ORF6和ORF7读码框的全长基因,产物回收后分别与PUC18和PMD18-T载体连接并转化DH5αE.coli,经氨苄筛选及测序,建立克隆载体PUC18-GL、PUC18-M和PMD18T-ORF7;以构建的克隆载体为模板,用重新设计的引物构建了汉逊酵母分泌性穿梭载体,然后电转化至汉逊酵母基因组中。结果:所有重组质粒经PCR和酶切鉴定均出现目的片段,测序结果证实正确,目的基因ORF5、ORF6与酵母重组成功。结论:构建了含有目的基因ORF5、ORF6的重组酵母工程菌,为实现分泌表达目的蛋白,进而研制病毒亚单位疫苗及诊断试剂提供了物质基础。

不同剂次重组乙型病毒性肝炎疫苗(汉逊酵母)加强免疫效果研究

目的比较不同剂次重组乙型病毒性肝炎(乙肝)疫苗(汉逊酵母)(HepB-HPY)加强免疫效果。方法选择出生时完成乙肝疫苗(HepB)基础免疫的>5岁儿童1981例,采集血清,使用化学发光法检测乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒表面抗体(抗-HBs)、乙肝病毒核心抗体(抗-HBc),对仅抗-HBs阳性者接种1剂次、抗-HBs阴性者接种3剂次10μg HepB-HPY,免后1月采血检测抗-HBs。结果加强免疫前、加强免疫1剂次和3剂次HepB-HPY后抗-HBs阳性率分别为38.62%、95.66%和99.75%,三者两两之间差异均有统计学意义(χ2=73.794～1736.113,均P<0.05)。抗-HBs阴性者加强免疫1剂次和3剂次后抗-HBs阳转率分别为92.93%和99.67%,差异有统计学意义(χ2=77.582,P<0.05);加强免疫1剂次、3剂次HepB-HPY后抗-HBs几何平均浓度(GMC)分别为783.23 mIU/ml和2463.97 mIU/ml,抗体滴度差异有统计学意义(t=-14.201,P<0.05)。与免前抗体浓度水平<1 mIU/ml的儿童相比,抗-HBs滴度在1～10 mIU/ml的儿童加强免疫1剂后抗体阳转率和GMC都要更高,差异有统计学意义(所有P<0.05)。结论采用10μg HepB-HPY对5～8岁抗-HBs阴性儿童加强免疫1剂次、对9岁以上抗-HBs阴性儿童加强免疫3剂次,免疫效果良好。

接种不同剂量重组乙型肝炎疫苗(酵母、汉逊酵母)的血清抗体应答

目的观察乙型肝炎(乙肝)病毒表面抗原[Hepatitis B Virus(HBV)Surface Antigen,HBsAg]、抗乙肝病毒表面抗原抗体[Antibody to HBsAg,Anti-HBs]、抗乙肝病毒核心抗原抗体(Antibody to HBV Core Antigen,Anti-HBc)阴性人群,全程接种不同剂量重组乙肝疫苗(酵母)[Hepatitis B Vaccine(HepB)Made by RecombinantDeoxyribonucleic Acid(DNA)Techniques in Yeast,HepB-Y]、重组乙肝疫苗(汉逊酵母)(HepB Made by RecombinantDNA Techniques in Hansenula Polymorpha Yeast,HepB-HPY)后的血清抗体应答。方法采集受种者接种后28～45d的静脉血,用固相放射免疫方法检测Anti-HBs。结果<16岁HBsAg、Anti-HBs、Anti-HBc均阴性人群,接种5μg HepB-Y后,Anti-HBs阳转率和几何平均浓度(Geometrical Mean Concentration,GMC)分别为97.23%和199.26mlU/ml(毫国际单位/毫升);接种10μg HepB-HPY后,Anti-HBs阳转率和GMC分别为100.00%和270.71mlU/ml,两组Anti-HBs阳转率和GMC差异均有统计学意义。≥16岁HBsAg、Anti-HBs、Anti-HBc均阴性人群,接种10μg HepB-Y后,Anti-HBs阳转率和GMC分别为88.72%、101.19mlU/ml;接种10μg HepB-HPY后Anti-HBs阳转率和GMC分别为94.20%、162.17mlU/ml,两组Anti-HBs阳转率和GMC差异均有统计学意义。结论HBsAg、Anti-HBs、Anti-HBc均阴性人群,接种HepB-Y、HepB-HPY后均能获得较好的Anti-HBs应答;<16岁人群接种10μg HepB-HPY后,能获得较接种5μg HepB-Y高的Anti-HBs阳转率和GMC;≥16岁人群接种HepB-HPY后,Anti-HBs应答优于接种HepB-Y。

成人接种不同剂量重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)的免疫学效果评价

目的观察成人接种不同剂量重组乙型肝炎(乙肝)疫苗(汉逊酵母)(Hepatitis B Vaccine Made by Recombinant Deoxyribonucleic Acid Techniques inHansenrla PolymorphaYeast,HepB-HPY)的免疫学效果。方法选择无HepB接种史和接种禁忌证,实验室筛检乙肝病毒(Hepatitis B Virus,HBV)标志物乙肝病毒表面抗原(HBV Surface Antigen,HBsAg)、抗乙肝病毒表面抗原抗体(Antibody to HBsAg,Anti-HBs)、抗乙肝病毒核心抗原抗体均阴性,丙氨酸氨基转移酶正常,年龄≥15岁的在校学生1600人作为观察对象。采用随机、双盲、对照原则,将入选的观察对象分为两组,每组各800人,以0、1、6个月全程免疫程序,分别接种20微克(g)和10 g HepB-HPY,受试者在免疫前、全程免疫后第4周采集静脉血,检测Anti-HBs。结果20 g组和10 g组Anti-HBs阳性[≥10毫国际单位/毫升(mIU/ml)]率分别为99.41%和98.03%,Anti-HBs几何平均浓度(Geometric Mean Concentration,GMC)分别为1511.88mIU/ml和1398.32mIU/ml。结论成人接种20 g和10 g HepB-HPY的免疫学效果良好,接种20 g HepB-HPY免疫学效果更好。

表达乙型肝炎表面抗原重组汉逊酵母细胞破碎率的检测

目的建立快速检测表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)重组汉逊酵母细胞破碎率的方法。方法分别以显微镜计数法和染色后毛细管离心法检测表达HBsAg的重组汉逊酵母细胞破碎率,并采用Lowry法检测细胞破碎前后上清液中蛋白质含量,以间接评价细胞破碎率。3种方法均以表达HBsAg的重组酿酒酵母细胞作为对照。结果显微镜计数法可直接计算出细胞的破碎率,结果可靠,但不同人员检测数据存在差异;毛细管离心法检测细胞破碎率结果与显微镜计数法接近,且较显微镜计数法稳定,汉逊酵母细胞破碎悬液经考马斯亮蓝染色效果较好;Lowry法检测细胞破碎后的蛋白释出度与细胞破碎率呈对应性。结论 3种实验方法均可评价细胞破碎率,毛细管离心法快速简便,在实际生产过程中较为实用。

藏族易感人群重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)免疫应答观察及影响因素分析

目的观察重组乙型肝炎(乙肝)疫苗(汉逊酵母)[Hepatitis B Vaccine Made by Recombinant Deoxyribonucleic Acid Techniquesin Hansenula Polymorpha Yeast,HepB-HPY]在藏族易感人群中的免疫应答,探讨其影响因素。方法为1609名从横断面调查中筛选出的乙肝病毒(Hepatitis B Virus,HBV)易感者,接种HepB-HPY,剂量10微克/毫升(μg/ml),免疫程序0、1、6个月。首剂免疫7个月后,随机整群选择615名受种者填写调查表,采集静脉血标本,用固相放射免疫测定法定性检测乙肝病毒表面抗原(HBV Surface Antigen,HBsAg)、抗乙肝病毒核心抗原抗体,用Abbott公司的微粒子酶免疫试剂定量检测抗乙肝病毒表面抗原抗体(Antibody to HBsAg,Anti-HBs)。结果共有549名受种者Anti-HBs阳转,阳转率89.3%,阳转者Anti-HBs几何平均浓度(Geometric Mean Concentration,GMC)为3514.6毫国际单位/毫升(mIU/ml)。通过Logistic回归分析,Anti-HBs阳转率和GMC均呈随年龄增大而降低的趋势,而与受种者的性别、职业、居住地等无关。结论藏族易感人群对HepB-HPY有良好的免疫应答。Anti-HBs阳转率和GMC均与受种者的年龄有关,而与受种者的性别、职业、居住地等无关。